Μονάδα:
Τμήμα ΒιολογίαςΒιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών
Ημερομηνία κατάθεσης:
2020-02-21
Συγγραφέας:
ΤΑΤΟΥΛΗ ΜΑΡΙΑ-ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Διαμάντης Σίδερης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΉ ΤΗΣ ΑΝΘΡΏΠΙΝΗΣ RNase κ
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΣΤΟΙΧΕΙΩΝ ΤΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΉ ΤΗΣ ΑΝΘΡΏΠΙΝΗΣ RNase κ
Περίληψη:
Ενώ η δομική οργάνωση του γονιδίου είναι γνωστή και έχουν προσδιοριστεί και απομονωθεί πολλά εναλλακτικά μετάγραφα, δεν είναι γνωστή η ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου. Ο υποκινητής ελέγχει την έναρξη της μεταγραφής, συνεπώς ο προσδιορισμός του θα δώσει πολλές απαντήσεις στο τρόπο ρύθμισης του γονιδίου σε επίπεδο μεταγραφής. Σκοπός της παρούσας διπλωματικής εργασία είναι ο προσδιορισμός στοιχείων του υποκινητή του γονιδίου, που κωδικοποιεί την ανθρώπινη RNase κ και ο έλεγχος της ενεργότητας αυτών τόσο ποιοτικά όσο και ποσοτικά.
Για το σκοπό αυτό, κρίθηκε απαραίτητο, να γίνουν περαιτέρω κλωνοποιήσεις τμημάτων καθοδικά του σημείου έναρξης της μεταγραφής του γονιδίου της RNase κ, διότι έπειτα από αναζητήσεις σε βάσεις δεδομένων (www.ensembl.org) εντοπίστηκαν 2 περιοχές: μία εντός του πρώτου εξωνίου και μία εντός του πρώτου εσωνίου του γονιδίου, οι οποίες πιθανώς συμβάλλουν στην ρύθμιση της μεταγραφής του γονιδίου της RNase κ, ως ενισχυτές. Οι περιοχές αυτές χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία κατασκευών ελέγχου της γονιδιακής έκφρασης. Πιο συγκεκριμένα, κλωνοποιήθηκαν σε πλασμίδια έκφρασης, ανοδικά του γονιδίου αναφοράς που κωδικοποιεί την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (TurboGFP). Για τον έλεγχο των πειραμάτων, κατασκευάστηκαν και χρησιμοποιήθηκαν πλασμίδια-μάρτυρες. Ως θετικοί μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν δύο πλασμίδια, που έφεραν ανοδικά του γονιδίου αναφοράς το ένα τον ιικό υποκινητή CMV και το άλλο τον υποκινητή του ενδογενούς ιδιοσυστατικού γονιδίου GAPDH. Ως αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιήθηκε το πλασμίδιο χωρίς υποκινητή ανοδικά του γονιδίου αναφοράς TurboGFP.
Οι παραπάνω γονιδιακές κατασκευές χρησιμοποιήθηκαν για την διαμόλυνση (transfection) ανθρώπινων ευκαρυωτικών κυττάρων. Ακολούθησε η ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης, μέσω του φθορισμού που εκπέμπει η πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (TurboGFP). Αρχικά πραγματοποιήθηκε ποιοτική ανάλυση των δεδομένων με παρατήρηση των επιπέδων φθορισμού της TurboGFP σε μικροσκόπιο φθορισμού. Ακολούθησε ποσοτικός έλεγχος των επιπέδων έκφρασης, με αρχική λύση των ευκαρυωτικών κυττάρων στα οποία έχουν εισαχθεί τα πλασμίδια, μέτρηση των επιπέδων φθορισμού της GFP σε φθορισμόμετρο και έπειτα μέτρηση της ολικής πρωτεΐνης με τη μέθοδο Bradford για κανονικοποίηση των αποτελεσμάτων.
Κύρια θεματική κατηγορία:
Θετικές Επιστήμες
Λέξεις-κλειδιά:
ριβονουκλεάση κ, υποκινητής, ενισχυτή, γονίδιο αναφοράς GFP, κυτταρική σειρά HEK293, πλασμίδιο
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
12
Αρχείο:
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.
ΜΕΛΕΤΗ ΤΟΥ ΥΠΟΚΙΝΗΤΗ ΤΗΣ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ RNase κ.pdf
3 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.
