Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Χρήστος Κοντός, Επίκουρος καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Σε όλους τους ευκαρυωτικούς οργανισμούς πραγματοποιείται η διαδικασία την συρραφής, στα πρόδρομα μετάγραφα των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, με στόχο τον σχηματισμό ώριμων mRNAs, μέσα από την αποβολή εσωνίων και συρραφή εξωνίων. Το φαινόμενο εναλλακτικής συρραφής δίνει την δυνατότητα δημιουργίας ποικιλίας mRNA μεταγράφων τα οποία προέρχονται από ένα μόνο γονίδιο. Η πολυπλοκότητα της συγκεκριμένης διαδικασίας, δικαιολογεί την αυστηρή ρύθμιση στην οποία υπόκειται. Ωστόσο, παρατηρούνται αρκετά φαινόμενα ρυθμιστικής δυσλειτουργίας, τα οποία μπορεί να σχετίζονται άμεσα με δυσπλασίες. Έτσι, πολλά εναλλακτικά μετάγραφα τα οποία παράγονται από μη αναμενόμενα γεγονότα συρραφής, μπορεί να αντιπροσωπεύουν πιθανούς καρκινικούς βιοδείκτες ή θεραπευτικούς στόχους.
Η οικογένεια ανθρώπινων γονιδίων των καλλικρεϊνών (KLKs) , αποτελείται από 15 μέλη και κωδικοποιεί τη μεγαλύτερη ομάδα πρωτεασών σερίνης. Τα KLKs έχουν μεγάλη ομοιότητα και αποτελούνται από πέντε κωδικά εξώνια παρόμοιου μεγέθους καθώς και συντηρημένες αλληλουχίες εσωνίων. Επιπλέον, ως οικογένεια γονιδίων, παρουσιάζει αρκετά φαινόμενα εναλλακτικής συρραφής, με κύρια την παράλειψη εξωνίων, τη διατήρηση εσωνίων, την εναλλακτική 5΄ και 3΄ θέση συρραφής καθώς και τη χρήση εναλλακτικών θέσεων πολυαδενυλίωσης. Αρκετά από τα εναλλακτικά μετάγραφα, μπορεί να εμφανίζουν μη φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης σε διάφορες κακοήθειες, έχοντας προγνωστική ή/και διαγνωστική αξία. Είναι πλέον γνωστό, οτι τα mRNAs των καλλικρεϊνών, στοχεύονται από συγκεκριμένα miRNAs μόρια, στις 3΄-UTR περιοχές τους, ρυθμίζοντας την έκφρασή τους.
Η μελέτη της εναλλακτικής συρραφής έχει επεκταθεί αρκετά, κυρίως με τη χρήση της τεχνολογίας της αλληλούχησης νέας γενιάς (NGS). Συγκεκριμένα, η αλληλούχηση RNA (RNA seq) δίνει τη δυνατότητα ανάλυσης του mRNA εναλλακτικού ματίσματος και την ανίχνευση νέων εναλλακτικών μεταγράφων, με υψηλή ευαισθησία και ακρίβεια. Συνδυαστικά με την τεχνική ταχείας ενίσχυσης των 3’-άκρων cDNA (3΄-RACE), μπορεί να προσφέρει την δυνατότητα μελέτης των εναλλακτικών θέσεων πολυαδενυλίωσης και την ανίχνευση εναλλακτικών 3΄-αμετάφραστων περιοχών (3´-UTRs) στα KLKs.
Στόχος της παρούσας διπλωματικής εργασίας ήταν η ανίχνευση και ταυτοποίηση νέων εναλλακτικών 3´-αμετάφραστων περιοχών (3´-UTRs) στα ανθρώπινα γονίδια της οικογένειας των καλλικρεϊνών, με τη χρήση και ανάλυση δεδομένων αλληλούχησης νέας
γενιάς (NGS). Για την επίτευξη του στόχου αυτού, έγινε βιοπληροφορική ανάλυση των δεδομένων από NGS για την επιλογή των KLK γονιδίων και των θέσεών τους, τα οποία διαθέτουν πιθανάν νέα εναλλακτικά 3΄-UTRs. Έπειτα, πραγματοποιήθηκε nested 3' RACE με τη χρήση ειδικών ζευγών εκκινητών, επιτρέποντας την ενίσχυση των ανθρώπινων μεταγράφων των γονιδίων KLKs, σε συνολικά 32 κυτταρικές σειρές από ανθρώπινους καρκινικούς ιστούς. Ακολούθως, η ταυτοποίηση των νέων εναλλακτικών 3΄-UTRs τα οποία ανακαλύφθηκαν, έγινε μέσω αλληλούχησης κατα Sanger.
Συνολικά, ταυτοποιήθηκαν 2 νέα εναλλακτικά 3’-UTRs σε μετάγραφα του γονιδίου KLK7 και ένα τμήμα νέου εναλλακτικού 3’-UTR σε μετάγραφα του γονιδίου KLK14. Επιπλέον, έγινε εντοπισμός της θέσης και του μήκους αλληλουχίας, 7 επιπλέον πιθανών εναλλακτικών 3’-UTRs, σε μετάγραφα των KLKs, όπως υποστηρίζουν τα αποτελέσματα από τις ηλεκτροφορήσεις των προϊόντων των αντιδράσεων 3΄-RACE, για τα οποία απαιτείται περαιτέρω μελέτη για την ταυτοποίησή τους. Από την μελέτη των μεταγράφων των γονιδίων των καλλικρεϊνών, παρατηρήθηκε μεγάλη διαφορά στα μήκη και την αλληλουχία των 3΄-UTRs που περιλαμβάνουν. Κατ΄ επέκταση, παρατηρούνται και διαφορετικά μόρια miRNA τα οποία δυνητικά μπορούν να στοχεύσουν τα εναλλακτικά 3΄-UTRs, όπως αποκαλύπτουν διάφοροι αλγόριθμοι εύρεσης miRNA μορίων στόχευσης γονιδίων.
Τα νέα εναλλακτικά 3΄-UTRs τα οποία ταυτοποιήθηκαν είναι μόνο λίγα από τα πληθώρα εναλλακτικών 3΄-UTRs που πιθανά διαθέτουν τα διάφορα μετάγραφα των συγκεκριμένων γονιδίων. Η στόχευση των περιοχών αυτών από miRNA μόρια και η κατα συνέπεια ρύθμιση που υπόκεινται τα γονίδια αυτά, όσον αφορά τα επίπεδα έκφρασής τους, ιδιαίτερα σε περιπτώσεις κακοηθειών, οδηγεί στην αναγκαιότητα περαιτέρω μελέτης των 3΄-εναλλακτικών μεταγράφων των γονιδίων των καλλικρεϊνών, καθώς μπορούν να αποτελέσουν σημαντικούς διαγνωστικούς ή/και προγνωστικούς καρκινικούς βιοδείκτες.
