Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Επίκουρος Καθηγητής Χρήστος Κοντός στο Τμήμα Βιολογίας του Εθνικού και Καποδιστριακού Πανεπιστημίου Αθηνών
Περίληψη:
Στην παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η ύπαρξη κυκλικών RNAs του γονιδίου PRMT1 σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα παχέος εντέρου. Το συγκεκριμένο γονίδιο κωδικοποιεί την πρωτεϊνική μεθυλτρανσφεράση αργινίνης 1, ένα ένζυμο που λειτουργεί ως μεθυλτρανσφεράση ιστόνης ειδική για την ιστόνη Η4 στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Η μεθυλίωση της συγκεκριμένη ιστόνης από το ένζυμο επάγει την αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, επηρεάζοντας μία πληθώρα σημαντικών κυτταρικών λειτουργιών, όπως τη σηματοδότηση, την επιδιόρθωση του DNA, την ωρίμανση και μεταφορά του RNA από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα, την προστασία των πρωτεϊνών, τη συναρμολόγηση των ριβοσωμάτων, καθώς και τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.
Το κυκλικό RNA (ή το CircRNA ) είναι ένας τύπος μονόκλωνου RNA το οποίο, σε αντίθεση με το γραμμικό RNA, σχηματίζει έναν ομοιοπολικά κλειστό, συνεχή βρόχο και παράγεται από ένα μη κανονικό συμβάν ματίσματος. Τα circRNAs έχει διαπιστωθεί ότι συμμετέχουν στην ρύθμιση της έκφρασης των γονικών γονιδίων, του εναλλακτικού ματίσματος, της μεταγραφής καθώς και της μετάφρασης. Επίσης, μπορούν δράσουν ως σπόγγοι για miRNAs, RBPs και ως «δολώματα» πρωτεϊνών. Έχει παρατηρηθεί ότι κάποια κυκλικά RNAs μπορούν και μεταφράζονται σε πεπτίδια / πρωτεΐνες. Ακόμη, τα circRNAs συμμετέχουν στην ρύθμιση σε καρκινικά κύτταρα με ποικίλους τρόπους, επηρεάζοντας την πορεία της γονιδιακής έκφρασης, αλληλοεπιδρώντας με πρωτεΐνες και άλλων ειδών RNAs καθώς και μέσω επιγενετικών μηχανισμών.
Κατά την εκτέλεση της παρούσας διπλωματικής εργασίας διεξάχθηκε η αναζήτηση κυκλικών RNAs στο γονίδιο PRMT1 σε καρκινικές σειρές κυττάρων παχέος εντέρου, μέσω μιας σειράς πειραμάτων που περιλάμβαναν την απομόνωση RNA, τον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης του, την εφαρμογή των μεθόδων της αντίστροφης μεταγραφής, της επάλληλης αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης και της αλληλούχησης κατά Sanger.
Αρχικά, πραγματοποιήθηκε ανάλυση έκφρασης του γονιδίου PRMT1 σε 55 κυτταρικές σειρές διαφορετικής ιστικής προέλευσης. Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκε PCR με divergent - εκκινητές σε κάποιες από αυτές τις σειρές, με στόχο να διαπιστωθεί η ύπαρξη κυκλικών RNAs. Επιλέξαμε να συνεχίσουμε με τις σειρές του καρκίνου του παχέος εντέρου. Δημιουργήθηκε ένα cDNA pool από 6 σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου (DLD-1, Colo 205, HT-29, RKO, Caco-2, HCT-116), το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως εκμαγείο για την πραγματοποίηση επάλληλης εμφωλιασμένης PCR. Τα προϊόντα της PCR ηλεκτροφορήθηκαν σε πήκτωμα αγαρόζης. Η ζώνη ενδιαφέροντος που παρατηρήθηκε, καθαρίστηκε με χρήση μικροφυγοκεντρικών στηλών και αλληλουχήθηκε κατά Sanger, με αποτέλεσμα την εύρεση ενός νέου κυκλικού RNA το οποίο συνίσταται από το κομμάτι του 1ου εξωνίου, ολόκληρου του 4ου εξωνίου και κομμάτι το 5ου εξώνιο του PRMT1.
Συνεπώς, η πειραματική διαδικασία που ακολουθήθηκε οδήγησε στην εύρεση ενός καινούργιου μορίου το οποίο μελετήθηκε περεταίρω στην παρούσα εργασία με βιοπληροφορικές μεθόδους. Πιο αναλυτικά, πραγματοποιήθηκε πρόβλεψη πιθανών αλληλεπιδράσεων του κυκλικού αυτού μορίου με miRNAs καθώς και με πρωτεΐνες. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε αναζήτηση ανοιχτών πλαισίων ανάγνωσης και εσωτερικών θέσεων πρόσδεσης ριβοσωμάτων.
Παρ’ όλα αυτά η παρούσα διπλωματική εργασία αποτελεί μια πρώτη προσέγγιση του θέματος η οποία επιδέχεται αρκετών βελτιστοποιήσεων. Επιπροσθέτως, με αφορμή τη συγκεκριμένη εργασία, μπορούν να γίνουν επιπλέον πειράματα που θα σχετίζονται με την περαιτέρω μελέτη του συγκεκριμένου κυκλικού RNA που θα αφορούν αφενός τη δράση και τη λειτουργεία του στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου αφετέρου την ύπαρξη του και σε άλλες κυτταρικές σειρές και ιστούς εκτός αυτών που μελετήθηκαν.
