Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Εμμανουήλ Γ. Φραγκούλης - Καθηγητής , Διδώ Βασιλακοπούλου - Αναπληρώτρια Καθηγήτρια (Επιβλέπουσα), Ευστάθιος Γκόνος - Διευθυντής Ερευνών Ινστιτούτου Βιολογικών Ερευνών και Βιοτεχνολογίας, Εθνικό Ίδρυμα Ερευνών, Εργ. Μοριακής και Κυτταρικής Γήρανσης
Περίληψη:
Η γήρανση αποτελεί μία φυσιολογική, μη αναστρέψιμη διαδικασία, η οποία
εμφανίζεται σε όλους του οργανισμούς ξεκινώντας από τα κατώτερα ασπόνδυλα και
επηρεάζεται τόσο από γενετικούς όσο και από περιβαλλοντικούς παράγοντες.
Ειδικότερα, η γήρανση των πολυκύτταρων οργανισμών περιλαμβάνει διάφορα στάδια,
τα οποία χαρακτηρίζονται από μη αντιστρεπτές μεταβολές στην ανατομία, στη
φυσιολογία, καθώς και στην προσαρμοστικότητά τους. Η γήρανση αφορά πολλαπλά
όργανα και ιστούς και τελικά οδηγεί σε προοδευτικό και γενικευμένο εκφυλισμό
της κυτταρικής ομοιοστασίας, δηλαδή της ικανότητας του οργανισμού να διατηρεί
τη δομική και λειτουργική του ακεραιότητα.
Η γήρανση των ανθρώπινων ινοβλαστών συνοδεύεται από μεταβολές σε διάφορες
βιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένης και της μείωσης της λειτουργίας του
πρωτεοσώματος. Το πρωτεόσωμα, ένα πολυενζυμικό, μη λυσοσωμικό σύμπλοκο και
ιδιαίτερα ο ATP-εξαρτώμενος πρωτεολυτικός μηχανισμός που πραγματοποιείται από
το 26S πρωτεόσωμα ευθύνεται για την αποδόμηση φυσιολογικών και μη πρωτεϊνών,
προκειμένου να διατηρηθεί η φυσιολογική κυτταρική λειτουργία. Κατά τη φάση της
αναδιπλασιαστικής γήρανσης, το πρωτεόσωμα παρουσιάζει μειωμένη έκφραση και
λειτουργία, ενώ η αυξημένη έκφρασή του καθυστερεί το φαινόμενο της γήρανσης σε
ανθρώπινους ινοβλάστες.
Η πρωτεΐνη p53 είναι ένας από τους σημαντικότερους μεταγραφικούς παράγοντες των
κυττάρων, υπεύθυνος για πολυάριθμες βιολογικές διεργασίες, όπως η απόκριση στο
κυτταρικό στρες, η απόπτωση, η ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και η γήρανση. Στα
κύτταρα των θηλαστικών, η γήρανση που επάγεται από την p53 πρωτεΐνη συμβαίνει
είτε όταν τα τελομερή εξαντλούνται, με αποτέλεσμα την αναδιπλασιαστική γήρανση
(replicative senescence) είτε έπειτα από επιζήμια κυτταρική βλάβη, όπως είναι η
κυτταρική γήρανση που επάγεται από στρες (stress-induced cellular senescence).
Έχουν διατυπωθεί πολυάριθμες θεωρίες σχετικά με την κεντρική λειτουργία της
πρωτεΐνης p53 στη γήρανση των οργανισμών. Η p53 είναι υπεύθυνη για την επαγωγή
και τη διατήρηση του γηρασμένου φαινοτύπου, αλλά σε περίπτωση απώλειας της p53
μόνο τα υψηλά επίπεδα του αναστολέα p16 είναι ικανά να κάνουν τη διαδικασία μη
αντιστρεπτή. Οι ογκοκατασταλτικές ιδιότητες της p53 εν μέρει εκτελούνται μέσω
της επαγωγής της κυτταρικής γήρανσης και κατ’ επέκταση της γήρανσης των
οργανισμών. Φυσικά, η λειτουργία της p53 πρέπει να εξηγηθεί μέσα από το
πολύπλοκο δίκτυο των πρωτεϊνών με τις οποίες αλληλεπιδρά.
Σε φυσιολογικές συνθήκες στο κύτταρο, τα επίπεδα της p53 πρωτεΐνης βρίσκονται
σε χαμηλά επίπεδα, διατηρούμενα σε μία ισορροπία μεταξύ της διαδικασίας της
σωστής αναδίπλωσης και της πρωτεολυτικής αποδόμησης. Αρκετά γονίδια-στόχοι του
μεταγραφικού παράγοντα p53 αναστέλλουν την ενεργότητα του p53 μέσω ενός
αυτορυθμιζόμενου κύκλου αρνητικής ανάδρασης. Ο p53 ενεργοποιεί τον κύριο
αρνητικό ρυθμιστή του, το γονίδιο mdm2, μία λιγάση ουμπικιτίνης. Η Mdm2 λιγάση
με τη σειρά της απενεργοποιεί την πρωτεΐνη p53, κυρίως σημαίνοντάς την για
πρωτεοσωμική αποδόμηση και προωθώντας την έξοδό της από τον πυρήνα. Παρόμοια,
τα γονίδια-στόχοι Cop1 και Pirh2 κωδικοποιούν για Ε3 λιγάσες, που είναι ικανές
να αποδομήσουν την p53. Ο αριθμός των λιγασών που μπορούν να ουμπικιτυλιώσουν
την p53 ανεξάρτητα από την Mdm2 συνεχώς αυξάνει. Εκτός από τις προαναφερθείσες
λιγάσες της p53, βασικές θεωρούνται επίσης, η CHIP και η Topors.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίστηκε ο μηχανισμός με τον οποίο
ρυθμίζεται η σταθερότητα της πρωτεΐνης p53 κατά την κυτταρική γήρανση
ανθρώπινων ινοβλαστών. Δεδομένου ότι η p53 σημαίνεται για ουμπικιτυλίωση από
αρκετές Ε3 λιγάσες, οι οποίες δρουν ανεξάρτητα η μία από την άλλη, ελέγχθηκε
εάν κάποια από αυτές εμφανίζει ειδική δραστικότητα κατά την αναδιπλασιαστική
γήρανση. Έτσι, παρόλο που η p53 βρέθηκε ότι έχει μειωμένη έκφραση και
λειτουργία στους γηρασμένους ινοβλάστες, η CHIP είναι η μόνη από τις βασικές
λιγάσες της p53 που μελετήθηκαν, η οποία επάγεται σε μεταγραφικό και σε
πρωτεϊνικό επίπεδο κατά τη γήρανση. Αντίθετα, η αποσιώπηση της έκφρασης της
CHIP λιγάσης οδήγησε τους ανθρώπινους ινοβλάστες σε πρόωρη γήρανση. Παράλληλα,
κατά τη γήρανση, η CHIP μετατοπίζεται εν μέρει στον πυρήνα και παρουσιάζει
αυξημένα επίπεδα ουμπικιτυλίωσης, γεγονός που δεικνύει αυξημένη ενεργότητα
λιγάσης ουμπικιτίνης.
Στο σύνολο, σχεδόν, των επιστημονικών μελετών που αφορούν την p53, η Mdm2
θεωρείται ως η κύρια Ε3 λιγάση που ρυθμίζει τη σταθερότητα της p53 στα κύτταρα.
Εφόσον στους γηρασμένους ανθρώπινους ινοβλάστες βρέθηκε ότι η Mdm2 έχει
μειωμένη έκφραση, ελέγχθηκε κατά πόσο είναι λειτουργική στην κυτταρική γήρανση
και αντιπαρατέθηκε η δράση της με εκείνη της CHIP λιγάσης. Για το λόγο αυτό,
μελετήθηκε η επίδραση τόσο της υπερέκφρασης όσο και της αποσιώπησης της
έκφρασης της CHIP και της Mdm2, αλλά και η αναστολή της δραστικότητας της Mdm2
επάνω στα επίπεδα έκφρασης της p53 πρωτεΐνης. Βρέθηκε, λοιπόν, ότι η
υπερέκφραση της CHIP στα νεαρά κύτταρα, σε επίπεδα παρόμοια με αυτά που
ανιχνεύτηκαν κατά τη γήρανση, οδηγεί σε αποδόμηση της p53 κάτω από τα βασικά
της επίπεδα που φυσιολογικά παρατηρούνται στα νεαρά κύτταρα. Επιπλέον, ενώ η
εξαρτώμενη από την Mdm2 ρύθμιση της p53 λαμβάνει χώρα τόσο στα νεαρά όσο και
στα γηρασμένα κύτταρα, η CHIP λιγάση συμβάλει στη ρύθμιση των επιπέδων της p53
κυρίως στη γήρανση.
Επιπρόσθετα, είναι πλέον γνωστό ότι η CHIP αποτελεί βασικό αλληλεπιδρόν μόριο
των κύριων κυτταροπλασματικών σαπερονών, γνωστές ως πρωτεΐνες θερμικού σοκ
Hsp70/90 και τη συν-συνοδό πρωτεΐνη Hsp40, καθώς επίσης ότι η p53 ρυθμίζεται
από αυτές τις σαπερόνες. Έτσι, ελέγχθηκαν τα επίπεδα των προαναφερθέντων
πρωτεϊνών, τα οποία βρέθηκαν μειωμένα στα γηρασμένα κύτταρα, δεικνύοντας μία
ελλάττωση του μηχανισμού πρωτεϊνικής αναδίπλωσης κατά τη γήρανση. Ακόμα,
αναλύθηκε η επίδραση της αναστολής της δραστικότητας της Hsp90 επάνω στο προφίλ
έκφρασης της p53, η οποία βρέθηκε ότι αποδομείται ραγδαία στους γηρασμένους
ινοβλάστες, εξαιτίας της εξειδικευμένης αύξησης των επιπέδων αλλά και της
ενεργότητας λιγάσης ουμπικιτίνης της CHIP. Επομένως, τα παραπάνω δεδομένα
καταδεικνύουν την εξειδικευμένη δράση της CHIP λιγάσης, αλλά και την υπερίσχυση
του πρωτεολυτικού συστήματος με τη μεσολάβηση της CHIP για την αποδόμηση της
p53 πρωτεΐνης έναντι του συστήματος των μοριακών σαπερονών κατά την κυτταρική
γήρανση. Συνοπτικά, η CHIP λιγάση εμπλέκεται στη ρύθμιση του p53 μονοπατιού
κατά την εκδήλωση του φαινομένου της αναδιπλασιαστικής γήρανσης.
