Περίληψη:
Τα σηματοδοτικά μονοπάτια των ενεργοποιούμενων από μιτογόνα ερεθίσματα
πρωτεΐνικών κινασών [Mitogen Activated Protein Kinases, (MAPKs)] είναι εκτενώς
μελετημένα και ρυθμίζουν πληθώρα βιολογικών διαδικασιών, όπως ο κυτταρικός
πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση και η ωσμορύθμιση. Μέχρι στιγμής,
έχουν χαρακτηριστεί τρεις υποοικογένειες των MAPKs, αυτή των ελεγχόμενων από
εξωκυττάρια ερεθίσματα κινασών [Extracellular signal Regulated Kinases, (ERK)],
η υποοικογένεια των πρωτεϊνικών κινασών του αμινοτελικού άκρου του μεταγραφικού
παράγοντα c-Jun [c-Jun N-terminal Kinases, (JNK)] και τέλος η υποοικογένεια των
p38 κινασών. Οι κινάσες JNK και p38, συνιστούν τις ενεργοποιούμενες από στρες
πρωτεϊνικές κινάσες [Stress Activated Protein Kinases, (SAPKs)] καθώς η
ενεργοποίηση τους επάγεται κατά ειδικό τρόπο σε συνθήκες παρειβαλλοντικού στρες.
Η ένταση και η διάρκεια της ενεργοποίησης των MAPKs έχουν δειχθεί να επηρεάζουν
την τελική απόκριση του κυττάρου σε δεδομένο ερέθισμα. Οι φωσφατάσες διπλής
εξειδίκευσης [Dual Specificity Phosphatases, (DUSPs)] αποτελούν κύριους
ρυθμιστές της ενεργότητας των MAPΚs κατά την διάρκεια της ανάπτυξης, της
καρκινικής εξαλλαγής, καθώς επίσης και υπό συνθήκες περιβαλλοντικού στρες.
Οι DUSPs ανήκουν στην υπέρ-οικογένεια των πρωτεϊνικών φωσφατασών
τυροσίνης [Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs)]. Η ενζυμική τους ενεργότητα
βασίζεται στην κυστεΐνη του ενεργού τους κέντρου, ενώ δύνανται να
αποφωσφορυλιώσουν τόσο κατάλοιπα φώσφο-τυροσίνης όσο κατάλοιπα φώσφο-θρεονίνης.
Στα θηλαστικά, αρκετά μέλη της οικογένειας των DUSPs εμφανίζουν εξειδίκευση
έναντι των MAPKs.
Η ανάλυση του γονιδιώματος της Drosophila σε συνδυασμό με γενετικές μελέτες
έδειξε ότι τα βασικά χαρακτηριστικά της σηματοδότησης μέσω MAPKs είναι
συντηρημένα μεταξύ της Drosophila και των θηλαστικών, καθιστώντας τη Drosophila
κατάλληλο οργανισμό – πρότυπο για την μελέτη τους. Αντίστοιχα, έξι DUSPs έχουν
εντοπιστεί στο γονιδίωμα της Drosophila, εκ των οποίων η φωσφατάση Puckered
είναι το πιο καλά χαρακτηρισμένο μέλος τους. Η Puckered αρχικά ταυτοποιήθηκε ως
η JNK-ειδική φωσφατάση υπεύθυνη για την καταστολή της σηματοδότησης μέσω JNK,
κατά τα αρχικά στάδια του «ραχιαίου κλεισίματος» (dorsal closure), ενός
μορφογενετικού γεγονότος της εμβρυϊκής ζωής της Drosοphila melanogaster.
Μετέπειτα μελέτες επιβεβαίωσαν την συμμετοχή της φωσφατάσης Puckered και σε
άλλες αναπτυξιακές διαδικασίες. Στην ενήλικη Drosophila, η δράση της φωσφατάσης
Puckered έχει δειχτεί να επηρεάζει την ανοσολογική απόκριση, την επούλωση
τραυμάτων, την ανοχή του στρες καθώς επίσης την επιμήκυνση της βιωσιμότητας του
οργανισμού.
Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η λειτουργική ανάλυση
των DUSPs στη Drosophila melanogaster. Συγκεκριμένα, το ενδιαφέρον μας
εστιάστηκε στην φωσφατάση Puckered και στην ανάλυση των μηχανισμών μετα-
μεταφραστικής ρύθμισης της δράσης της. Παράλληλα επιχειρήσαμε να διαλευκάνουμε
τον λειτουργικό ρόλο της Puckered in vivo, κατά την ανάπτυξη και λειτουργία του
νευρικού συστήματος του εντόμου.
In silico ανάλυση της αμινοξικής ακολουθίας της Puckered έδειξε εννέα πιθανές
θέσεις MAPK-εξαρτώμενης φωσφορυλίωσης, γεγονός που μας ώθησε να εξετάσουμε κατά
πόσο η Puckered φωσφορυλιώνεται από αυτή την κατηγορία κινασών. Για τον σκοπό
αυτό εκφράσαμε την Puckered στο ετερόλογο σύστημα της κυτταρικής σειράς HEK293
και επιδράσαμε στα κύτταρα με αρσενικό νάτριο προκειμένου να επάγουμε την
ενεργότητα των ΜAPKs. Το αρσενικό νάτριο είναι ισχυρός επαγωγέας συνθηκών
οξειδωτικού στρες στο κύτταρο και ενεργοποιεί κατά κύριο λόγο τις SAPKs, ενώ,
σε μικρότερο βαθμό, ενεργοποιούνται και οι κινάσες ERK1/2. Η επίδραση με
αρσενικό νάτριο σε κύτταρα, που είχαν υποστεί διαμόλυνση ώστε να εκφράζουν την
Puckered, είχε ως αποτέλεσμα την επιβράδυνση της ηλεκτροφορητικής κινητικότητας
της Puckered σε αποδιατακτικά πηκτώματα ακρυλαμιδίου.
Η εν λόγω αλλαγή στην ηλεκτροφορητική συμπεριφορά της Puckered οφείλονταν σε
φωσφορυλίωση του μορίου της, όπως διαπιστώσαμε μετά από επίδραση με το ένζυμο λ-
φωσφατάση σε ανοσο-κατακρημνίσματα της πρωτεΐνης, τα οποία είχαν προκύψει από
εκχυλίσματα κυττάρων που συν-έκφραζαν την Puckered με την ενεργό μορφή της
κινάσης JNK.
Η συν-έκφραση της Puckered με τις συνεχώς ενεργές μορφές των κινασών JNK και
p38, στα κύτταρα ΗΕΚ293, οδηγεί σε φωσφορυλίωση του μορίου της, ενώ αντίθετα, η
επαγωγή της ενεργότητας των ERK, μετά από διέγερση των κυττάρων με τον
επιδερμικό αυξητικό παράγοντα, δεν είχε καμία επίδραση στο μόριο της Puckered.
Επιπροσθέτως, η ταυτόχρονη αναστολή των κινασών JNK και p38, με χρήση των
χημικών αναστολέων SP600125 και SB203580, μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της
επαγόμενης από αρσενικό νάτριο φωσφορυλίωσης της Puckered, ενώ η παρεμπόδιση
της ενεργοποίησης των ERK1/2 μέσω του αναστολέα PD98059 δεν επέφερε καμία
αλλαγή στα επίπεδα φωσφορυλίωσης του μορίου της.
Συνεπώς από τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων οδηγηθήκαμε στο συμπέρασμα ότι
η Puckered φωσφορυλιώνεται από τις κινάσες JNK και p38 σε συνθήκες οξειδωτικού
στρες επαγόμενου από αρσενικό νάτριο.
Η ανάλυση ανοσο-κατακρημνισμάτων της Puckered μέσω φασματογραφίας μαζών οδήγησε
στην ανίχνευση φωσφορυλίωσης του καταλοίπου σερίνης της θέσης 413, η οποία
ωστόσο ανιχνεύθηκε τόσο παρουσία όσο και απουσία συνθηκών οξειδωτικού στρες.
Βάση της παρατηρούμενης επιβράδυνση της Puckered σε συνθήκες οξειδωτικού στρες,
εικάζουμε ότι η θέση φωσφορυλίωσης στο κατάλοιπο σερίνης 413, δεν είναι
μοναδική και ότι πιθανώς υπάρχουν και άλλες θέσεις, οι οποίες διέφυγαν
ανίχνευσης στο σύστημα μας.
Στη συνέχεια, προκειμένου να εξετάσουμε την επίδραση της φωσφορυλίωσης στη
δράση της Puckered εξετάσαμε τόσο την αλληλεπίδραση της με τις SAPKs όσο και
την ενεργότητα της έναντι της JNK.
H αλληλεπίδραση της Puckered με την κινάση p38 ανιχνεύθηκε τόσο υπό
φυσιολογικές όσο και υπό συνθήκες οξειδωτικού στρες, αν και σε συνθήκες στρες
ήταν ενισχυμένη. Αντίθετα, η αλληλεπίδραση της Puckered με την κινάση JNK ήταν
ανιχνεύσιμη μόνο σε συνθήκες οξειδωτικού στρες. Συνεπώς η Puckered αλληλεπιδρά
με τις SAPKs ενώ η αλληλεπίδραση ενισχύεται σε συνθήκες οξειδωτικού στρες.
Τέλος, σε πειράματα όπου η επίδραση με αρσενικό νάτριο στα κύτταρα
πραγματοποιήθηκε για διαφορετικούς χρόνους επώασης, παρατηρήσαμε ότι η
φωσφορυλίωση της Puckered γίνεται σταδιακά φτάνοντας στο μέγιστο σημείο της στα
60 λεπτά επώασης. Η σύγκριση των επιπέδων ενεργοποίησης της κινάσης JNK
παρουσία και απουσία τις Puckered, στους ίδιους χρόνους επώασης, έδειξε ότι η
παρουσία της Puckered επιφέρει στατιστικά σημαντική μείωση των επιπέδων
ενεργοποίησης της JNK, η οποία όμως είναι ορατή μέχρι τα 60 λεπτά επώασης,
δηλαδή μέχρι τη χρονική στιγμή όπου παρατηρείται το μέγιστο της φωσφορυλίωσης
του μορίου της. Συνεπώς, η φσωφορυλίωση της Puckered πιθανώς να επηρεάζει
αρνητικά την δράση της ως φωσφατάση.
Με στόχο την in vivo μελέτη της Puckered κατά την ανάπτυξη και λειτουργία του
νευρικού συστήματος της Drosophila melanogaster, προχωρήσαμε στην ανάπτυξη των
κατάλληλων εργαλείων. Αρχικά δημιουργήσαμε διαγονιδιακές σειρές σιώπησης, οι
οποίες θα μας επέτρεπαν την χωροχρονικά κατευθυνόμενη σιώπηση του γονιδίου
puckered στη Drosophila, ενώ τη συνέχεια, αναπτύξαμε πολυκλωνικό ορό έναντι του
καρβοξυ-τελικού τμήματος της πρωτεΐνης με στόχο την ανίχνευση του ενδογενούς
μορίου στους ιστούς του εντόμου.
Η σιώπηση του γονιδίου puckered σε όλους τους μετα-μιτωτικούς νευρώνες του
εντόμου, τόσο κατά τη διάρκεια της εμβρυϊκής ανάπτυξης όσο και κατά τα
αναπτυξιακά στάδια της προνύμφης 1ου και 2ου σταδίου, είχε ως αποτέλεσμα την
κατά 100% θνησιμότητα του οργανισμού.
Ο χαρακτηρισμός του φαινοτύπου σε έμβρυα στα οποία είχε προηγηθεί σιώπηση του
γονιδίου puckered σε όλους του μετα-μιτωτικούς νευρώνες έδειξε αλλοιώσεις στην
μορφολογία τόσο του αξονικού ικριώματος στο Κεντρικό Νευρικό Σύστημα (ΚΝΣ), όσο
και στην δομή των περιφερικών νεύρων. Αντίστοιχος ήταν ο φαινότυπος της
σιώπησης του γονιδίου puckered στα κύτταρα της μέσης γραμμής του ΚΝΣ. Η
γενετική ανατομή της εν λόγω κυτταρικής ομάδας έδειξε ότι το puckered κατέχει
ρόλο στους νευρώνες και όχι στα γλοιακά κύτταρα της μέσης γραμμής.
Τα αποτελέσματα αυτά ενισχύονται και από την μελέτη του προτύπου έκφρασης του
puckered στο εμβρυϊκό νευρικό σύστημα, όπου δεν εντοπίστηκε έκφραση του
γονιδίου σε γλοιακά κύτταρα. Αντίθετα, η ανάλυση εμβρύων σειρών αναφοράς του
puckered έδειξε ότι το εν λόγω γονίδιο εκφράζεται σε συγκεκριμένους πληθυσμούς
νευρώνων, τόσο στην κοιλιακή νευρική χορδή όσο και στο περιφερικό νευρικό
σύστημα. Συγκεκριμένα, η έκφραση του puckered ανιχνεύθηκε στου κινητικούς
νευρώνες aCC/RP2 και U, καθώς και τους ενδιάμεσους νευρώνες pCC και EL. Ο ανοσο-
εντοπισμός της ενδογενούς Ρuckered με τον πολυκλωνικό ορό που αναπτύξαμε
απέδωσε σήμα στις διαμήκεις και εγκάρσιες συνδετικές οδούς του αξονικού
ικριώματος, υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο της Ρuckered στους άξονες. Αξίζει να
σημειωθεί, ότι το πρότυπο έκφρασης του puckered είναι δυναμικό και αυξάνει σε
πολυπλοκότητα κατά τη εξέλιξη της εμβρυϊκής ανάπτυξης.
Τέλος, διαπιστώσαμε ότι το puckered εκφράζεται και στο ΚΝΣ του ενηλίκου της
Drosophila, όπου εντοπίζεται τόσο σε νευρικά όσο και σε γλοιακά κύτταρα. Η
διακοπή της νευροδιαβίβασης στο κύκλωμα των νευρώνων που εκφράζουν το puckered
οδηγεί σε παράλυση του εντόμου.
