Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Καθηγητής Σταύρος Ι. Χαμόδρακας Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστήμιο Αθηνών (επιβλέπων), Ερευνητής Α Κώστας Ιατρού Ινστιτούτο Βιολογίας Ε.Κ.Ε.Φ.Ε. Δημόκριτος, Αν. Καθηγητής Σπύρος Ευθυμιόπουλος Τμήμα Βιολογίας Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Η οικογένεια των πρωτεϊνών αγκυροβόλησης CAV (CAP, ArgBP2, Vinecin), που
χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη τριών SH3 περιοχών στο καρβοξυ-τελικό τους άκρο
και μιας περιοχής με ομοιότητα με το πεπτίδιο σορβίνης (sorbin homology, SoHo)
προς το αμινο-τελικό άκρο, εμπλέκεται σε σηματοδοτικά μονοπάτια που οδηγούν στη
ρύθμιση των επαφών μεταξύ κυττάρων, στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού και
στην απόκριση σε αυξητικούς παράγοντες. Στην παρούσα εργασία περιγράφεται η
αναγνώριση και ο χαρακτηρισμός ενός νέου μέλους της οικογένειας CAV, που
εκφράζεται στον μεταξοσκώληκα Bombyx mori, την BmSH3. Η BmSH3 απομονώθηκε
αρχικά ως πιθανός στόχος αλληλεπίδρασης με τον ορφανό πυρηνικό υποδοχέα BmE75C,
ένα μεταγραφικό παράγοντα που εκφράζεται στα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθυλακίων
και εμπλέκεται στην καταστολή της σύνθεσης της ειδικής πρωτεΐνης του αυγού
(ESP, Egg Specific Protein) κατά τη μετάβαση από τη βιτελλογένεση στη
χοριογένεση.
Ανιχνεύτηκαν τρία μετάγραφα του γονιδίου BmSH3, τα BmSH3-A1, BmSH3-A2 και
BmSH3-B. Με την μελέτη του προτύπου μεταγραφής του γονιδίου bmsh3διαπιστώθηκε η
έκφρασή του σε όλους τους ιστούς του B. mori που εξετάστηκαν. Συγκεκριμένα, το
μετάγραφο BmSH3-A1 ανιχνεύτηκε σε όλους τους ιστούς, που αναλύθηκαν, το
BmSH3-A2 βρέθηκε στην ωοθήκη και στο κεφάλι ενώ το BmSH3-Bανιχνεύτηκε
αποκλειστικά στην ωοθήκη. Ειδικά για τα μετάγραφα BmSH3-A1 και
BmSH3-B,διαπιστώθηκε η συστατική συσσώρευσή τους σε όλα τα στάδια της ωογένεσης
που μελετήθηκαν.
Για την μελέτη της πρωτεϊνικής έκφρασης της BmSH3 παράχθηκαν δύο αντισώματα, το
anti-BmSH3.1 έναντι της περιοχής που συνδέει τη SoHo με την πρώτη SH3 περιοχή
και το anti-BmSH3.2 έναντι των SH3 περιοχών. Με πειράματα τύπου Western κατέστη
δυνατή η αναγνώριση πολλαπλών πιθανών ισομορφών της BmSH3 σε όλους τους ιστούς
του μεταξοσκώληκα που μελετήθηκαν. Για την ειδική μελέτη της BmSH3-A1,
χρησιμοποιήθηκε το anti-BmSH3.1 αντίσωμα. Πειράματα τύπου Western με τη χρήση
του anti-BmSH3.1 επιβεβαίωσαν την ειδική έκφραση της BmSH3 σε εκχυλίσματα από
τους ιστούς της ωοθήκης, όπου αναγνωρίστηκαν δύο ζώνες μοριακού βάρους 75 kDa
και 85 kDa. Προτείνεται ότι οι ισομορφές αυτές προέρχονται από ειδική
πρωτεόλυση της αυθεντικής BmSH3-A1, που αναγνωρίστηκε ακέραιη στο περίβλημα των
ωοθυλακίων (sheath) μεμοριακό βάρος άνω των 120 kDa.
Η κατανομή της BmSH3 σε κυτταροσειρές εντόμων προσδιορίστηκε με τη μελέτη της
χιμαιρικής πρωτεΐνης EYFP-BmSH3 καθώς και της αυθεντικής BmSH3-A1, με
ανοσοφθορισμό. Και στις δύο περιπτώσεις η BmSH3 βρέθηκε να έχει
κυτταροπλασματική κατανομή.
Μελετήθηκε επίσης η υποκυτταρική κατανομή της BmSH3-A1 σε κύτταρα εντόμων μετά
από συνδιαμόλυνση με τον φορέα έκφρασης για τον παράγονταBmE75A ή τονBmE75C.
Ενδιαφέρον παρουσίασε ο εντοπισμός του BmE75C: εκτός από τον αναμενόμενο
πυρηνικό εντοπισμό βρέθηκε και ο έντονος κυτταροπλασματικός εντοπισμός του, με
συνεντοπισμό του με την BmSH3, σε δομές των κυττάρων που μοιάζουν με
ψευδοπόδια, στα φιλοπόδια και λαμελλοπόδια. Η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών
επιβεβαιώθηκε και με δοκιμές ανοσοκατακρήμνισης, στην ίδια κυτταρική σειρά. Η
παρατήρηση αυτή είναι σημαντική γιατί υποδεικνύει νέες λειτουργικές ιδιότητες
για την BmE75C, όπως τη συμμετοχή της στην μετανάστευση των κυττάρων μέσω της
αλληλεπίδρασης με την BmSH3. Επιπλέον, πιθανολογείται η εμπλοκή της στη
διαφοροποίηση της λειτουργίας της BmE75C.Ο εντοπισμός του ορφανού πυρηνικού
υποδοχέα BmE75C στο κυτταρόπλασμα παρουσιάζεται για πρώτη φορά καιο
συνεντοπισμός του με την BmSH3 σε ειδικές δομές, όπως τα ψευδοπόδια, ανοίγει
νέες προοπτικές για τους πιθανούς ρόλους του BmE75C στην οργάνωση του
κυτταροσκελετού.
Μεγάλο ενδιαφέρον όμως παρουσίασε και η υποκυτταρική κατανομή της BmSH3 στα
θυλακοκύτταρα των ωοθυλακίων. Κατά τη βιττελλογένεση παρατηρήθηκε o
κυτταροπλασματικός εντοπισμός της στα θυλακοκύτταρα. Σημαντική αλλαγή του
προτύπου φθορισμού παρατηρήθηκε κατά τη χοριογένεση. Ειδικότερα κατά την πρώιμη
χοριογένεση, η BmSH3 ανιχνεύτηκε κυρίως στο κυτταρόπλασμα των θυλακοκυττάρων,
στις μεσαίες τομές αυτών και, αμυδρά, στην κορυφαία και στη βασική πλευρά και
στις συνεκτικές επαφές μεταξύ των κυττάρων. Κατά την όψιμη χοριογένεση, η
κατανομή της BmSH3 στα επιθηλιακά διαφοροποιείται και εμφανίζει πολικότητα.
Συγκεκριμένα, παρατηρήθηκε η απουσία της BmSH3 από τις μεσαίες τομές των
κυττάρων και η συσσώρευσή της περιμεμβρανικά, στις επαφές μεταξύ των κυττάρων
και στη βασική και την κορυφαία πλευρά. Επιπλέον, στην κορυφαία πλευρά των
θυλακοκυττάρων η BmSH3 εντοπίστηκε σε μεγάλα κοκκία, τα οποία αντικατοπτρίζουν
την δομή του σχηματιζόμενου χορίου, γεγονός που υπονοεί την εμπλοκή της BmSH3
στον μηχανισμό έκκρισης των πρωτεϊνών του χορίου.
Συμπερασματικά προτείνεται ότι εκτός από τη συμμετοχή της στην αναδιοργάνωση
του κυτταροσκελετού, όπως συμβαίνει με όλες τις μέχρι τώρα χαρακτηρισμένες
πρωτεΐνες της οικογένειας CAV, η BmSH3 πιθανά εμπλέκεται και στους μηχανισμούς
ανάπτυξης των ωοθυλακίων. Ειδικότερα, είναι πιθανό ότι συμμετέχει σε
διαδικασίες όπως (α) το κλείσιμο των αυλακώσεων μεταξύ των θυλακοκυττάρων, που
σχηματίζονται κατά το στάδιο της βιτελλογένεσης κατά τη μετάβαση από τη
βιτελλογένεση στη χοριογένεση με την συμμετοχή της στον σχηματισμό συνεκτικών
επιφανειών μεταξύ των θυλακοκυττάρων και (β) στο μηχανισμό έκκρισης των
πρωτεϊνών του χορίου.
Λέξεις-κλειδιά:
Μεταξοσκώληκας, Ωογένεση, Πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις, Κυτταροσκελετός, Bombyx mori
