Μονάδα:
Διατμηματικό / Διϊδρυτικό ΠΜΣ Μοριακή ΙατρικήΒιβλιοθήκη Επιστημών Υγείας
Ημερομηνία κατάθεσης:
2016-12-05
Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Ευθυμιόπουλος Σπύρος, Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, ΕΚΠΑ
Βεκρέλλης Κώστας, Ερευνητής Β, Τομέας Βασικής Έρευνας, ΙΙΒΕΑΑ
Πολίτης Παναγιώτης, Ερευνητής Γ, Τομέας Βασικής Έρευνας, ΙΙΒΕΑΑ
Πρωτότυπος Τίτλος:
Μελέτη της επίδρασης αναστολέων της φωσφολιπάσης Α2 στην τοξικότητα και την φλεμονώδη απόκριση που προκαλεί η συσσώρευση της α-συνουκλεΐνης in vitro και in vivo
Γλώσσες εργασίας:
Ελληνικά
Μεταφρασμένος τίτλος:
Effect of PLA2 inhibitors in α-synuclein mediated toxicity and inflammation in vitro and in vivo
Περίληψη:
Η α-συνουκλεΐνη είναι μια προσυναπτική πρωτεΐνη που έχει συνδεθεί με την παθογένεια της Νόσου του Πάρκινσον (ΝΠ). Υπό απροσδιόριστες ακόμα συνθήκες η α-συνουκλεΐνη συσσωρεύεται σχηματίζοντας ολιγομερείς μορφές που θεωρούνται υπεύθυνες για την νευρωνική τοξικότητα. Τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα φαίνεται να αλληλεπιδρούν με την α-συνουκλεΐνη συμβάλλοντας στην συσσωμάτωσή της. Ένα τέτοιο λιπαρό οξύ είναι το αραχιδονικό οξύ που απελευθερώνεται από τις κυτταρικές μεμβράνες από την φωσφολιπάση Α2 (PLA2). Στην ΝΠ έχει παρατηρηθεί αυξημένη δράση της PLΑ2 που συνοδεύεται από αυξημένη απελευθέρωση αραχιδονικού οξέος από τις μεμβράνες. Αυξημένη δράση της PLA2 οδηγεί σε αύξηση των εικοσανοειδών παραγώγων του αραχιδονικού και ενεργοποίηση του σηματοδοτικού καταρράκτη τους. Η σηματοδότηση των εικοσανοειδών είναι άρρηκτα συνδεδεμένη με τη φλεγμονή που φαίνεται να έχει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ΝΠ. Σκοπός τη παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της επίδρασης της αναστολής της PLΑ2 και της ακόλουθης μείωσης του αραχιδονικού οξέος στην τοξικότητα της α-συνουκλεΐνη in vitro και της επαγόμενης φλεγμονώδους απόκρισης in vivo.
Για την in vitro μελέτη εφαρμόσαμε νέους αναστολείς της PLΑ2 στην κυτταρική σειρά νευροβλαστώματος SH-SY5Y που εκφράζει με επαγόμενο τρόπο την αγρίου τύπου α-συνουκλεΐνη. Παρατηρήσαμε ότι συγκεκριμένοι αναστολείς αύξησαν την επιβίωση νευρωνικά διαφοροποιημένων κυττάρων σε σχέση με κύτταρα μάρτυρες που εκφράζουν τα εγγενή επίπεδα της πρωτεΐνης. Περαιτέρω ανάλυση έδειξε ότι η αυξημένη επιβίωση συνοδεύεται από δραματική μείωση των ενδοκυττάριων επιπέδων της μονομερούς και ολιγομερούς α-συνουκλεΐνης. Για να διευκρινίζουμε τον μηχανισμό με τον οποίο οι αναστολείς προκαλλούν τη μείωση των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης ελέγξαμε τους μηχανισμούς έκκρισης και αποικοδόμησης της πρωτεΐνης. Ποσοτικοποιήση της εξωκυττάριας α-συνουκλεΐνης στο μέσον ανάπτυξης των κυττάρων δεν έδειξε αλλαγές στα επίπεδα της εκκρινόμενης α-συνουκλεΐνης υπό την επίδραση των αναστολέων. Η δραστικότητα του πρωτεασώματος, η οποία μετρήθηκε με ειδικό φθορισμογόνο πεπτίδιο, δεν φάνηκε να επηρρεάζεται κατά την αναστολή της PLΑ2. Αξιολόγηση της αποικοδόμησης μέσω αυτοφαγίας πραγματοποιήθηκε ελέγχοντας την μακροαυτοφαγίας και την αυτοφαγία διαμεσολαβούμενη από συνοδές πρωτεΐνες (CMA). Ο έλεγχος της αυτοφαγίας πραγματοποιήθηκε προσδιορίζοντας τον σχηματισμό αυτοφαγικών κυστιδίων με τη χρήση του δείκτη LC3. Η επίδραση των αναστολέων δεν φάνηκε να επηρεάζει την ροή της μακροαυτοφαγίας. Επιπλαίον ο έλεγχος της CMA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυττάρων SH-SY5Y που εκφράζουν την μεταλλαγμένη ΔDQ α–συνουκλεΐνη που δεν αναγνωρίζεται από τον υποδοχέα του λυσοσώματος και αποικοδομείται από το συγκεκριμένο μονοπάτι. Τα επίπεδα της ΔDQ α-συνουκλεΐνης παρουσίασαν εξίσσου δραματική μείωση κατά την αναστολή της PLA2 υποδεικνύοντας ότι η παρατηρούμενη μείωση δεν διενεργείται μέσω της CMA.
Για να μελετηθεί η αναστολή της PLA2 in vivo χρησιμοποιήσαμε διαγονιδιακούς μύες που εκφράζουν την ανθρώπινη μεταλλαγμένη A53T α-συνουκλεΐνη. Το μοντέλο χαρακτηρίζεται από αύξηση των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης στον εγκέφαλο, της οποίας η αύξηση των επιπέδων φαίνεται να ενεργοποιεί μια φλεγμονώδη απόκριση με την μορφή ενεργοποιημένης μικρογλοίας. Ο πιο δραστικός αναστολέας της PLA2 χορηγήθηκε με ενδοπεριτοναϊκή ένεση σε διαγονιδιακούς μύες όπου φάνηκε να επιδρά στα επίπεδα της α-συνουκλεΐνης, καθώς παρουσίασαν σημαντική μείωση στον φλοιό του εγκεφάλου προσεγγίζοντας αυτή των φυσιολογικών ζώων. Παράλληλα χρησιμοποιήθηκε κυτταρομεττρία ροής για τον προσδιορισμό του αριθμού των αστροκυττάρων, των μακροφάγων και των μικρογλοιακών κυττάρων και παρατηρήθηκε μικρή πτωτική τάση στον αριθμό τους σε όλες τις περιοχές του εγκεφάλου. Τέλος προσδιορίστηκαν τα επίπεδα των κυτταροκινών IFN-γ και IL-10 στον εγκέφαλο, όπου δεν παρατηρήθηκαν μεταβολές και στον σπλήνα και στους λεμφαδένες, όπου παρουσιάστηκαν σημαντικές αλλαγές κατά τη χορήγηση του αναστολέα.
Τα ευρήματα αυτά υπογραμμίζουν την σημασία των λιπαρών οξέων στην βιοχημεία της α-συνουκλεΐνης καθώς φαίνεται ότι η αναστολή της PLA2 στο κυτταρικό μοντέλο οδηγεί πιθανόν σε κάποια αλλαγή στην διαμόρφωση της πρωτεΐνης που έχει ως αποτέλεσμα την αυξημένη απομάκρυνση της και την αποικοδόμηση των ολιγομερών μορφών. Παρόμοια μείωση των επιπέδων της α-συνουκλεΐνης παρατηρήθηκε in vivo μαρτυρώντας ενδεχομένως την ύπραξη ενός κοινού ομοιοστατικού μηχανισμού που συνεισφέρει στην απομάκρυνση της α-συνουκλεΐνης όταν εκείνη βρίσκεται σε αυξημένα επίπεδα. Η αναστολή της PLA2 φάνηκε να προκαλεί κάποιες αλλαγές στην φλεγμονώδη απόκριση από την σκοπιά που μελετήθηκε. Μια πιο διεξοδική μελέτη κρίνεται απαραίτητη για να καθοριστεί ο ρόλος της PLA2 στην φλεγμονώδη απόκριση στο πειραματικό μοντέλο που χρησιμοποιήσαμε. Συμπερασματικά η διαλεύκανση του ακριβούς μηχανισμού που συνδέει την αλλαγή του λιπιδικού προφίλ του με την απομάκρυνση της α-συνουκλεΐνης θα μπορούσε να δώσει νεες προσεγγίσεις στην μελέτη των συνουκλεϊνοπαθειών και άλλων ασθενειών συναφών με τον σχηματισμό αμυλοειδών.
Λέξεις-κλειδιά:
α-συνουκλεΐνη, Φωσφολιπάση Α2, Λιπίδια, Τοξικότητα, Φλεγμονή
Αρ. σελίδων ευρετηρίου:
0
Αρ. βιβλιογραφικών αναφορών:
140
Αρχείο:
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.
XYLAKI MARY thesis.pdf
2 MB
Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.
