Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Ελευθέριος Βαϊρακτάρης, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Ευστράτιος Πατσούρης, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Χρήστος Τσιγκρής, Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Ανδρέας Λάζαρης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Ευστάθιος Μποβιάτσης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Σταύρος Βασιλείου, Επίκουρος Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Χρήστος Γιαπιτζάκης, Επίκουρος Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Εισαγωγή
Η καρκινογένεση είναι μια γενετική ασθένεια στο κυτταρικό επίπεδο. Αποτελεί μια περίπτωση μη αναστρέψιμης απώλειας της γονιδιακής ρύθμισης, που ελέγχει την ανάπτυξη και τη διαφοροποίηση. Η εκδήλωσή της οφείλεται σε αλλαγή του DNA και τα καρκινικά κύτταρα που προκύπτουν εμφανίζουν μια ανεξέλεγκτη µιτωτική δραστηριότητα που τα κάνει να είναι περισσότερο κοντά µε τα ανώριμα φυσιολογικά κύτταρα, παρά µε τους ώριμους διαφοροποιημένους κυτταρικούς τύπους, αφού παράγουν πρωτεΐνες χαρακτηριστικές των εμβρυικών κυττάρων. Σε κάθε φυσιολογικό κύτταρο υπάρχει µια άριστη ποσότητα για κάθε πρωτεΐνη. Διαταραχή της γονιδιακής ρύθμισης και έκφρασης εξαιτίας μεταλλαγών ή ακόμα και πολυμορφισμών στο DNA, αλλάζει αυτή την ποσότητα και το κύτταρο παύει να είναι φυσιολογικό και είναι πλέον μετασχηματισμένο. Σχεδόν όλα τα γονίδια που σχετίζονται με τον καρκίνο (ογκογονίδια, ογκοκατασταλτικά γονίδια, γονίδια επιδιόρθωσης του DNA κ.α.), έχουν με κάποιο τρόπο συμμετοχή στα πολυσύνθετα μοριακά μονοπάτια που καθορίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική διαφοροποίηση. Η ανάπτυξη του βασικοκυτταρικού καρκινώματος (ΒΚΚ), όπως και όλων των καρκινωμάτων, θεωρείται μια πολυπαραγοντική διαδικασία, η οποία οφείλεται κυρίως σε μεταλλάξεις σε ογκογονίδια, ογκοκατασταλτικά γονίδια και σε γονίδια επιδιόρθωσης του DNA, αλλά και σε περιβαλλοντολογικούς παράγοντες. Η διαδικασία εξέλιξης, που οδηγεί από την υπερπλασία (προκαρκινική κατάσταση) στην εμφάνιση του ΒΚΚ, πιστεύεται πως στηρίζεται στη συσσώρευση μεταλλαγών σε διάφορα γονίδια που ανήκουν σε κάποιες από τις προαναφερθείσες κατηγορίες, σε μια συγκεκριμένη ομάδα κυττάρων που θα προκαλέσουν τον πρωτογενή κακοήθη όγκο. Όμως, τα ογκογονίδια και τα ογκοκατασταλτικά γονίδια δεν είναι τα μόνα που μπορούν να οδηγήσουν στο ΒΚΚ. Πρόσφατα, έχουν συνδεθεί με την καρκινογένεση πολυμορφισμοί που επηρεάζουν την έκφραση γονιδίων, των οποίων τα πρωτεϊνικά προϊόντα μπορεί να είναι κυτοκίνες, παράγοντες που σχετίζονται με τη φλεγμονώδη αντίδραση, την ανοσολογική αντίδραση, την αγγειογένεση και τη λειτουργία του συνδετικού ιστού. Με δεδομένα τα παραπάνω, στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκαν λειτουργικοί μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί στα γονίδια των κυτοκινών ιντερλευκίνη-1β (IL-1β) και ιντερλευκίνη-10 (IL-10) και στο γονίδιο του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης (ACE). Μέσω της σύγκρισης των συχνοτήτων των αλληλομόρφων μεταξύ ασθενών με ΒΚΚ και υγιών μαρτύρων έγινε προσπάθεια να αντληθούν πληροφορίες για τους πολυμορφισμούς αυτούς και την πιθανή παθογενετική σχέση τους με το ΒΚΚ.
Υλικά και Μεθοδολογία
Η μελέτη έγινε σε δείγματα DNA που απομονώθηκε από λευκοκύτταρα του περιφερικού αίματος από 54 διαγνωσμένους ασθενείς με βασικοκυτταρικό καρκίνωμα και από 111 υγιείς μάρτυρες, που χρησιμοποιήθηκαν ως εκπρόσωποι του γενικού πληθυσμού για τη στατιστική σύγκριση των υπό εξέταση ασθενών. Στα άτομα αυτά μελετήθηκαν ο πολυμορφισμός +3953 C/T στο γονίδιο της ιντερλευκίνης-1β (IL-1β), ο πολυμορφισμός -1082 A/G στην περιοχή του υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-10 (IL-10) και ο πολυμορφισμός προσθήκης/έλλειψης (I/D) στο γονίδιο του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης (ACE).
Αποτελέσματα
Σχετικά με τον πολυμορφισμό +3953 C/T στο γονίδιο της ιντερλευκίνης-1β (IL-1β), στα δεδομένα της ομάδας των υγιών μαρτύρων (n=111), αυτός ανιχνεύθηκε σε 5 ομοζυγώτες (4,5%) και σε 39 ετεροζυγώτες (35,1%). Η συχνότητα εμφάνισης του αλληλομόρφου T για το συγκεκριμένο πολυμορφισμό στον υπό μελέτη πληθυσμό ήταν 22,1%. Αντίστοιχα, στην ομάδα των ασθενών (n=54), ο πολυμορφισμός +3953 C/T ανιχνεύθηκε σε 6 ομοζυγώτες (11,1%) και σε 16 ετεροζυγώτες (29,6%), μη αναδεικνύοντας έτσι στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την ομάδα των υγιών μαρτύρων (P>0,05).
Σχετικά με τον πολυμορφισμό -1082 A/G στο γονίδιο της ιντερλευκίνης-10 (IL-10), στα δεδομένα της ομάδας των υγιών μαρτύρων (n=111), αυτός ανιχνεύθηκε σε 1 ομοζυγώτη (0,9%) και σε 46 ετεροζυγώτες (41,4%). Η συχνότητα εμφάνισης του αλληλομόρφου G για το συγκεκριμένο πολυμορφισμό στον υπό μελέτη πληθυσμό ήταν 21,6%. Αντίστοιχα, στην ομάδα των ασθενών (n=54), ο πολυμορφισμός -1082 A/G ανιχνεύθηκε σε 1 ομοζυγώτη (1,9%) και σε 33 ετεροζυγώτες (61,1%), αναδεικνύοντας έτσι στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την ομάδα των υγιών μαρτύρων (P=0,019), η οποία αποδίδει στους ετεροζυγώτες 2,3 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ.
Σχετικά με τον πολυμορφισμό προσθήκης/έλλειψης μίας αλληλουχίας 287bp μέσα στο εσώνιο 16 του γονιδίου του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης (ACE), στα δεδομένα της ομάδας των υγιών μαρτύρων (n=111), ο πολυμορφισμός ανιχνεύθηκε σε 10 ομοζυγώτες (9%) και σε 49 ετεροζυγώτες (44,1%). Η συχνότητα εμφάνισης του αλληλομόρφου I για το συγκεκριμένο πολυμορφισμό στον υπό μελέτη πληθυσμό ήταν 31,1%. Αντίστοιχα, στην ομάδα των ασθενών (n=54), ο πολυμορφισμός προσθήκης/έλλειψης ανιχνεύθηκε σε 3 ομοζυγώτες (5,6%) και σε 12 ετεροζυγώτες (22,2%), αναδεικνύοντας έτσι στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την ομάδα των υγιών μαρτύρων (P=0,003), η οποία αποδίδει στους ετεροζυγώτες προφυλακτικό ρόλο έναντι στον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ.
Από την πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση με τη χρήση συντελεστών συσχέτισης κατά Pearson για τη συσχέτιση των ομοζυγωτών για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ (Μοντέλο Α), δεν βρέθηκε συσχέτιση των ομοζυγωτών με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ σε κανέναν από τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς.
Από την πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση με τη χρήση συντελεστών συσχέτισης κατά Pearson για τη συσχέτιση των ετεροζυγωτών για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ (Μοντέλο Β), βρέθηκε προστατευτική και επιβαρυντική συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ στους ετεροζυγώτες με το μεταλλαγμένο και το φυσιολογικό αλληλόμορφο στα γονίδια του ACE και της IL-10, αντίστοιχα.
Από την πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση με τη χρήση συντελεστών συσχέτισης κατά Pearson για τη συσχέτιση των ομοζυγωτών και των ετεροζυγωτών για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ (Μοντέλο Γ), βρέθηκε ότι ο ετερόζυγος γονότυπος για το γονίδιο του ACE προσδίδει προστατευτική δράση. Πιο συγκεκριμένα, προκύπτει ότι οι ετεροζυγώτες για το αλληλόμορφο του γονιδίου του ACE έχουν 2,8 φορές μικρότερο κίνδυνο να εμφανίσουν ΒΚΚ. Αντιθέτως, βρέθηκε ότι ο ετερόζυγος γονότυπος για το γονίδιο της IL-10 προσδίδει επιβαρυντική δράση. Πιο συγκεκριμένα, προκύπτει ότι οι ετεροζυγώτες για το αλληλόμορφο του γονιδίου της IL-10 έχουν 2,4 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να εμφανίσουν ΒΚΚ.
Συζήτηση
Από τα αποτελέσματα δεν προέκυψε κάποια στατιστικά σημαντική διαφορά σχετικά με τον πολυμορφισμό +3953 C/T στο γονίδιο της ιντερλευκίνης-1β (IL-1β) ανάμεσα στους υγιείς μάρτυρες και στους ασθενείς. Είναι λοιπόν προφανές πως η ύπαρξη του πολυμορφισμού +3953 C/T στο γονίδιο της IL-1β δεν αποτελεί προδιαθεσικό παράγοντα για την ανάπτυξη ΒΚΚ. Αυτό όμως δεν αποκλείει την επίδραση του πολυμορφισμού αυτού στη διηθητική ικανότητα του ΒΚΚ. Κρίνεται λοιπόν σκόπιμη μια πιο ολοκληρωμένη μελέτη του ρόλου της IL-1β στην εμφάνιση ΒΚΚ και η περαιτέρω διερεύνηση της αγγειογενετικής ικανότητας της IL-1β.
Σχετικά με τον πολυμορφισμό -1082 A/G στον υποκινητή του γονιδίου της ιντερλευκίνης-10 (IL-10), τα αποτελέσματα μέσω στατιστικά σημαντικής αυξημένης παρουσίας του G αλληλομόρφου, καταδεικνύουν αυξημένη ποσότητα της IL-10 στους ασθενείς με ΒΚΚ, σε σχέση με τους υγιείς μάρτυρες. Είναι λοιπόν προφανές πως στο ΒΚΚ η IL-10 συνεισφέρει θετικά στην ανάπτυξη και την προαγωγή του όγκου. Είναι αξιοσημείωτο πως μόνο οι ετεροζυγώτες για το G αλληλόμορφο βρέθηκαν να είναι στατιστικά σημαντικά περισσότεροι στους ασθενείς με ΒΚΚ και όχι οι ομοζυγώτες. Αυτό το εύρημα μπορεί πιθανότατα να εξηγείται λόγω της χαμηλής συχνότητας ατόμων με GG γονότυπο στο γενικό πληθυσμό, καθώς και λόγω του μικρού δείγματος ασθενών. Η εμπεριστατωμένη μελέτη του ρόλου της IL-10 στην ανάπτυξη ΒΚΚ είναι ένα περίπλοκο ζήτημα, λόγω της εν γένει σύνθετης in vivo σχέσης μεταξύ φλεγμονής και εξέλιξης του όγκου.
Σχετικά με τον πολυμορφισμό προσθήκης/έλλειψης στο εσώνιο 16 του γονιδίου του ενζύμου μετατροπής της αγγειοτενσίνης (ACE), έγινε ξεκάθαρο ότι ο πολυμορφισμός αυτός επηρεάζει το ρυθμό μεταγραφής του συγκεκριμένου γονιδίου. Συνεπώς, οι ομοζυγώτες ΙΙ έχουν περίπου το μισό επίπεδο ACE στο πλάσμα σε σύγκριση με τους ομοζυγώτες DD, ενώ οι ετεροζυγώτες ID εκθέτουν ένα ενδιάμεσο επίπεδο. Δεδομένων αυτών, στην παρούσα διατριβή, όπου διερευνήθηκαν οι συχνότητες των γονοτύπων και των αλληλομόρφων του πολυμορφισμού I/D του ΑCE σε ασθενείς με ΒΚΚ, σε σύγκριση με υγιείς μάρτυρες, στην ομάδα των ασθενών αναδείχθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά σε σχέση με την ομάδα των υγιών μαρτύρων, η οποία αποδίδει στους ετεροζυγώτες ID μειωμένο κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ. Ένας πιθανός μηχανισμός που εξηγεί την προστατευτική επίδραση του ID γονότυπου ενάντια στον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ μπορεί να περιλαμβάνει το προκύπτον προϊόν της δραστηριότητας του ACE, δηλαδή την αγγειοτενσίνη II, η οποία ασκεί την επιρροή της σε κύτταρα μέσω των υποδοχέων της AT1R και AT2R. Ο AT1R προάγει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την αγγειογένεση και τις φλεγμονώδεις αποκρίσεις, ενώ ο AT2R φαίνεται να ανταγωνίζεται αυτές τις λειτουργίες, αναστέλλοντας τον AT1R. Δεδομένου ότι η αγγειοτενσίνη ΙΙ συνδέεται με μεγαλύτερη ισχύ με τον AT2R σε σχέση με τον AT1R, στην περίπτωση των ετεροζυγωτών ID όπου τα επίπεδα της αγγειοτενσίνης II είναι ενδιάμεσα, η αγγειοτενσίνη ΙΙ συνδέεται κατά προτίμηση πρώτα με τον ΑΤ2R και δεν επαρκεί για να συνδεθεί με τον AT1R, και ως εκ τούτου ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός καταστέλλεται. Λόγω της ισχυρότερης σύνδεσης της αγγειοτενσίνης II με τον AT2R, παρά με τον AT1R, είναι αναμενόμενη η αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων στους ετεροζυγώτες ID, οι οποίοι παράγουν ενδιάμεσα επίπεδα ACE, και συνεπώς, προκύπτει ο προφυλακτικός ρόλος έναντι στον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ που παρατηρήθηκε σε αυτούς.
Σε ό,τι αφορά στη συνδυαστική ανάλυση για τη συσχέτιση των ομοζυγωτών για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ (Μοντέλο Α), οι συντελεστές συσχέτισης κατά Pearson για τους ομοζυγώτες για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε όλους τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς, σε σχέση με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ, δεν ανέδειξαν σε κανέναν από τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς συσχέτιση των ομοζυγωτών με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ.
Σε ό,τι αφορά στη συνδυαστική ανάλυση για τη συσχέτιση των ετεροζυγωτών για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ (Μοντέλο Β), οι συντελεστές συσχέτισης κατά Pearson για τους ετεροζυγώτες σε όλους τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς, σε σχέση με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ, ανέδειξαν προστατευτική και επιβαρυντική συσχέτιση με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ στους ετεροζυγώτες με το μεταλλαγμένο και το φυσιολογικό αλληλόμορφο στα γονίδια του ACE και της IL-10, αντίστοιχα.
Τέλος, σε ό,τι αφορά στη συνδυαστική ανάλυση για τη συσχέτιση των ομοζυγωτών και των ετεροζυγωτών για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ (Μοντέλο Γ), οι συντελεστές συσχέτισης κατά Pearson για τους ομοζυγώτες και τους ετεροζυγώτες για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο σε όλους τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς, σε σχέση με τον κίνδυνο εμφάνισης ΒΚΚ, έδειξαν ότι ο ετερόζυγος γονότυπος για το γονίδιο του ACE προσδίδει προστατευτική δράση. Πιο συγκεκριμένα, προκύπτει ότι οι ετεροζυγώτες για το αλληλόμορφο του γονιδίου του ACE έχουν 2,8 φορές μικρότερο κίνδυνο να εμφανίσουν ΒΚΚ. Αντιθέτως, βρέθηκε ότι ο ετερόζυγος γονότυπος για το γονίδιο της IL-10 προσδίδει επιβαρυντική δράση. Πιο συγκεκριμένα, προκύπτει ότι οι ετεροζυγώτες για το αλληλόμορφο του γονιδίου της IL-10 έχουν 2,4 φορές μεγαλύτερο κίνδυνο να εμφανίσουν ΒΚΚ.
Ένας πιθανός μοριακός μηχανισμός για την εμφάνιση ΒΚΚ θα μπορούσε να εμπλέκει την ταυτόχρονη ενεργοποίηση των AT1R και των AT2R υποδοχέων που οφείλεται στην πλεονάζουσα ποσότητα της αγγειοτενσίνης ΙΙ στον οργανισμό των ασθενών, η οποία ακυρώνει τον προαναφερθέντα προστατευτικό ρόλο των AT2R και προάγοντας τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την αγγειογένεση, οδηγεί πιθανότατα στην εμφάνιση ΒΚΚ. Συμπερασματικά, από τους υπό μελέτη πολυμορφισμούς στην παρούσα διατριβή, προέκυψε πως ο συνδυασμός των αυξημένων επιπέδων παραγωγής της IL-10 και της ενεργοποίησης των AT1R από την αγγειοτενσίνη ΙΙ, λειτουργεί επιβαρυντικά για την εμφάνιση ΒΚΚ. Κρίνεται λοιπόν σκόπιμη η περαιτέρω διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών που οδηγούν στην εμφάνιση ΒΚΚ, στα οποία μπορεί να εμπλέκονται και άλλα γονίδια.
