Κατεύθυνση Φαρμακευτική Ανάλυση - Έλεγχος ποιότητας
Βιβλιοθήκη Σχολής Θετικών Επιστημών

2017-06-25

2017

Παπανδρέου Μαρία-Έλενα

Λουκάς Ιωάννης, Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Παντερή Ειρήνη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Ντότσικας Ιωάννης, Επίκουρος Καθηγητής,Τμήμα Φαρμακευτικής, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών

Ανίχνευση και Ταυτοποίηση του Παθογόνου Ιού HPV με τις μεθόδους Real-Time PCR και PCR-RFLP

Ελληνικά

Ανίχνευση και Ταυτοποίηση του Παθογόνου Ιού HPV με τις μεθόδους Real-Time PCR και PCR-RFLP

Η λοίμωξη με τον ιό HPV αποτελεί ένα σημαντικό θέμα καθώς τα ποσοστά νέων περιστατικών αυξάνονται με ταχείς ρυθμούς. Έχουν ταυτοποιηθεί περισσότεροι από 130 τύποι HPV οι οποίοι με βάση το σχετικό κίνδυνο να οδηγήσουν σε ογκογόνο μετασχηματισμό διακρίνονται σε χαμηλού κινδύνου (LR) και σε υψηλού κινδύνου (HR) γονοτύπους. Η έγκαιρη ανίχνευση και ταυτοποίηση του HPV μπορεί να συμβάλλει στην επιλογή της θεραπείας και στη βελτίωση της παρακολούθησης των ασθενών μετά τη θεραπεία.
Στην εργασία μας, συμμετείχαν 410 δείγματα από τα οποία τα 380 προέρχονταν από γυναίκες και τα υπόλοιπα 30 από άντρες και η ανίχνευση και ταυτοποίηση των HPV έγινε με τις αναλυτικές μεθόδους PCR-RFLP και Real-Time PCR. Η δειγματοληψία έγινε τόσο από εξειδικευμένο προσωπικό όσο και από τις ίδιες τις ασθενείς με τη διαδικασία του self-sampling. Η απομόνωση του DNA από τα δείγματα έγινε με τρεις in house διαδικασίες (απομόνωση DNA με χλωροφορμο-ισοαμυλ-αλκοόλη 24:1, απομόνωση DNA από ιστούς και paraffin blocks, απομόνωση DNA από στυλεό) καθώς και με το πρωτόκολλο απομόνωσης γενετικού υλικού DNA του κιτ «Genomic DNA from tissue» της εταιρείας MACHEREY-NAGEL.
Στην ανάλυση με PCR- RFLP ενισχύεται το γενετικό υλικό των δειγμάτων με PCR και ακολουθεί ηλεκτροφόρηση όπου ελέγχεται αν τα δείγματα είναι θετικά ή αρνητικά στον ιό. Tο DNA των θετικών δειγμάτων ενισχύεται με μια δεύτερη PCR και ακολουθεί πέψη του DNA των δειγμάτων με τα περιοριστικά ένζυμα PstI, HaeIII, Rsal, DdeI (ανάλυση RFLP). Η ταυτοποίηση των HPVs γίνεται με παρατήρηση των περιοριστικών θραυσμάτων με μια δεύτερη ηλεκτροφόρηση. Για την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της ανάλυσης με τη μέθοδο περιορισμού RFPL χρησιμοποιήθηκε η β-γλοβίνη για εσωτερικό ενδογενή έλεγχο. Κατά την ταυτοποίηση με την αναλυτική μέθοδο Real-Time PCR, χρησιμοποιήθηκε το AmpliSens® HPV HCR genotype-titre-FRT PCR kit. Η μέθοδος βασίζεται στην ταυτόχρονη ενίσχυση σε πραγματικό χρόνο (multiplex PCR) των θραυσμάτων του DNA των HPV γονότυπων 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 και ενός θραύσματος DNA του γονιδίου της β-γλοβίνης σε ένα σωληνάριο. Το θραύσμα του DNA του γονιδίου της β-γλοβίνης χρησιμοποιήθηκε για εσωτερικό ενδογενή έλεγχο. Στη συνέχεια, έγινε σύγκριση των δύο μεθόδων, καταλήγοντας στο συμπέρασμα πώς η PCR-RFLP παρά το γεγονός ότι είναι μια υψηλής έντασης εργατικού δυναμικού και παρουσιάζει δυσκολία στην ερμηνεία των αποτελεσμάτων στις περιπτώσεις πολλαπλών μολύνσεων, είναι ιδιαίτερα κατάλληλη για την ανίχνευση του HPV σε επίπεδο ρουτίνας και σε περίπτωση περιορισμένων οικονομικών πόρων καθώς είναι απλή, αξιόπιστη και ευαίσθητη ως τεχνική. Από την άλλη, η Real-Time PCR παρουσιάζει μεγαλύτερη ευαισθησία και εκλεκτικότητα ενώ δίνει αναπαραγώγιμα αποτελέσματα.
Ο επιπολασμός του HPV βρέθηκε να είναι σχετικά υψηλός στην Ελλάδα με τους τύπους υψηλού κινδύνου να είναι η πιο συχνή αιτία λοίμωξης ειδικά στην ηλικιακή ομάδα 16-26 όπου θα μπορούσε να έχει γίνει χορήγηση του προληπτικού εμβολίου ώστε να μειωθεί ο κίνδυνος μόλυνσης. Τέλος, τα πιο κοινά ευρήματα ήταν η λοίμωξη με HPV, το LGSIL / CIN Ι (χαμηλού βαθμού πλακώδης ενδοεπιθηλιακή βλάβη), ASCUS (άτυπα πλακώδη κύτταρα απροσδιορίστου σημασίας), HGSIL / CIN II / CIN III (υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή βλάβη) και τα κονδυλώματα.

Θετικές Επιστήμες

Φαρμακευτική
Ανάλυση

Παθογόνος ιός, Ιός Ανθρώπινων Θηλωμάτων, Ανάλυση

Ναι

3

Ναι

90

119

Δεν επιτρέπεται η πρόσβαση στο αρχείο. H πρόσβαση επιτρέπεται μόνο εντός του δικτύου του ΕΚΠΑ.

https://pergamos.lib.uoa.gr/uoa/dl/object/1668260