Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Ειρήνη Λαμπρινουδάκη, Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Κωνσταντίνος Πανουλής, Αν. Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Βιολέττα Καψιμάλη-Βαϊοπούλου, Αν. Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Χρυσούλα-Ηλιάνα Νικολάου, Αν. Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Μακάριος Ελευθεριάδης, Επ. Καθηγητής, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Παναγιώτα Περβανίδου, Επ. Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Αικατερίνη Ντόμαλη, Επ. Καθηγήτρια, Ιατρική, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Ο έλεγχος αμφισβητούμενης γονικότητας απαιτεί τη χρήση πολύμορφων γενετικών τόπων, που κληρονομούνται σύμφωνα με τους νόμους του Mendel και καθορίζονται με ακριβείς και αναπαραγώγιμες μεθόδους. Οι μικρές επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες αυτοσωμικού DNA (aSTRs) και τα ανθρώπινα λευκοκυτταρικά αντιγόνα (HLA) αποτελούν γενετικά συστήματα που χρησιμοποιούνται ευρέως στον έλεγχο αμφισβητούμενης γονικότητας. Ωστόσο, τόσο το HLA σύστημα, όσο και οι aSTRs γενετικοί πολυμορφισμοί φέρουν μειονεκτήματα όπως: ανισορροπία σύνδεσης και επικράτηση ορισμένων αλληλομόρφων σε συγκεκριμένες πληθυσμιακές ομάδες (για τα HLA) και υψηλό ποσοστό μετάλλαξης που επηρεάζεται από την ηλικία και το φύλο των γονέων (για τα STRs).
Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η αξιολόγηση της χρήσης των aSTRs γενετικών δεικτών και η εφαρμογή της ανάλυσής τους ως μέθοδος εκλογής στην διερεύνηση αμφισβητούμενης γονικότητας.
Υλικό και μέθοδοι: Μεταξύ 792 περιπτώσεων αμφισβητούμενης γονικότητας Αστικού Δικαίου, καταχωρημένες στα αρχεία του Τμήματος Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας του ΓNA «Ο Ευαγγελισμός», επιλέχθηκε μία ομάδα 147 περιπτώσεων διερεύνησης γονικότητας (405 άτομα Ελληνικής καταγωγής, ήτοι 110trios/37duos περιπτώσεις, εκ των οποίων η μία πραγματοποιήθηκε μέσω των γονιών του εκλιπόντος ΦΠ, απουσία και του DNA της μητέρας). Η γονοτύπηση των δειγμάτων έγινε σε g-DNA από δείγματα περιφερικού αίματος ή/και παρειακού επιχρίσματος ως προς: α) HLA τάξης Ι (-Α*, -Β*, -Cw*) και τάξης II (-DRB1*, -DQB1*, -DPB1*) αλλήλια εφαρμόζοντας τις PCR-SSOP και/ή PCR-SSP τεχνικές σε επίπεδο χαμηλής/υψηλής ανάλυσης και β) 16-17 aSTRs πολυμορφισμούς (συμπεριλαμβανομένου και του γενετικού τόπου για τον καθορισμό του φύλου-Amelogenin) εφαρμόζοντας fragment analysis μεθοδολογία σε 3130 γενετικό αναλυτή. Οι δείκτες Power of exclusion (PE), Random man not excluded (RMNE), Combined Parentage Index (CPI) και probability of parentage (W), υπολογίστηκαν με βάση την συχνότητα των HLA και aSTRs αλληλίων στους Καυκάσιους.
Αποτελέσματα: Σε 38 περιπτώσεις (28trios/10duos) αποδείχτηκε ο αποκλεισμός της γονικότητας, με τεκμήρια αποκλεισμού σε ≥3 (aSTRs), >1 (HLA). Σε 108 περιπτώσεις (82 trios/26 duos) η γονικότητα δεν αποκλείστηκε. Τα αποτελέσματα ανάλυσης μέσω των δύο προσπελάσεων συμφωνούσαν οδηγώντας στην ανάθεση της γονικότητας σε όλες τις περιπτώσεις, εκτός από μία, που οι ελεγχόμενοι ΦΠ είχαν συγγενική σχέση μεταξύ τους (υπήρξε αποκλεισμός από τα aSTRs, όχι όμως από τα HLA αλλήλια). Οι χαμηλές τιμές WHLA:0.9870-0.9999 αυξήθηκαν έως και 0.9999999 μέσω των aSTRs. Οι δείκτες κυμάνθηκαν: 1. οι CPISTRs από 333 (duo) έως 6,76x1013 (trio) με στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ trios και duos (p˂0,0001) 2. οι RMNEaSTRs (1,14x10-5-9,64x10-13) (p˂0,0001), 3. οι PEaSTRs ξεπέρασαν το 0,999999. Επίσης, κατεγράφησαν επτά aSTRs μεταλλάξεις (D12S391 (2), SE33, D10S1248, vWA, D2S1338, D21S11) και 1 σιωπηλό αλλήλιο (SE33) σε ισάριθμες περιπτώσεις αμφισβητούμενης γονικότητας (8/188, 4.26%) (6trios/2duo). Αποδόθηκαν σε απώλεια ή προσθήκη μίας ή δύο τετρανουκλεοτιδικών επαναλήψεων. Η αναλογία πατρικής vs μητρικής μετάλλαξης/σιωπηλών αλληλίων ήταν 7:1 (p=0,036). Εντούτοις, στις περιπτώσεις αυτές δεν προέκυψε αποκλεισμός συγγένειας, καθότι ο αποκλεισμός απαιτεί δύο αλληλικές ανομοιότητες κατ’ελάχιστον. H γονικότητα επιβεβαιώθηκε και μέσω του HLA συστήματος (WHLA:0.9972-0.9999). Οι αθροιστικές τιμές WaSTRs+HLA ξεπέρασαν το 0.99999999.
Συμπεράσματα: Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τη χρησιμότητα και τη δύναμη της aSTR γονοτύπησης στην επίλυση περιστατικών αμφισβητούμενης πατρότητας/μητρότητας. Η μελέτη των 15-16 aSTRs αποτελεί μία ακριβή, επαναλήψιμη, υψηλής ευαισθησίας δοκιμασία, απλούστερη στην εκτέλεση και ταχύτερη από τις συμβατικές μεθόδους (HLA). Παρέχει επαρκώς τεκμηριωμένα δεδομένα για trio δοκιμασίες ελέγχου συγγένειας και είναι ιδιαίτερα χρήσιμη σε περιπτώσεις που το DNA της μητέρας δεν είναι διαθέσιμο, ή περιπτώσεις που ελέγχονται άτομα από την ίδια πατρική γενεαλογία. Δίνει αποδεκτά αποτελέσματα στον έλεγχο ατόμων με συγγενική σχέση μεταξύ τους. Όμως, ο συνδυασμός των δύο συστημάτων παρέχει υψηλότερη πληροφόρηση και μειώνει την πιθανότητα ψευδούς αποκλεισμού λόγω aSTRs μεταλλάξεων/σιωπηλών αλληλίων, ή ελαχιστοποιεί τον κίνδυνο εσφαλμένου μη αποκλεισμού, λόγω απουσίας του γενετικού προφίλ της μητέρας.
