Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Χρήστος Κρούπης, Αναπληρωτής Καθηγητής Κλινικής Βιοχημείας-Μοριακής Διαγνωστικής, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Μουτσάτσου-Λαδικού Παρασκευή, Καθηγήτρια Κλινικής Βιοχημείας- Ιατρικής Χημείας, Ιατρική Σχολή, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Ευρύκλεια Λιανίδου, Καθηγήτρια Αναλυτικής Χημείας-Κλινικής Χημείας, Τμήμα Χημείας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών
Περίληψη:
Εισαγωγή: Η μετωποκροταφική άνοια (Frontotemporal dementia, FTD) είναι το ίδιο συχνή σε άτομα με το Alzheimer’s σε ασθενείς <65 ετών και αφορά το 5-15% όλων των ανοιών παγκοσμίως. Αποτελείται από έναν αριθμό κλινικο-παθολογο-ανατομικών οντοτήτων, με κύρια σύνδρομα την bvFTD (behavioral variant FTD), τη PPΑ(Primary progressive Aphasia) και τη FTD-MND (Motor Neuron Disease), ενώ στο φάσμα της ανήκουν και τα σύνδρομα PSP (Progressive Supranuclear Palsy) και CBS (Cortico-basal Syndrome). Στην FTD εμπλέκονται πολλά γονίδια, όπως τα GRN, MAPT, C9orf72, TARDBP κλπ. Το γονίδιο TARDBP εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1 (1p36.22), αποτελείται από 6 εξόνια και κωδικοποιεί την πρωτεΐνη TDP-43 η οποία και έχει έως και 6 ισομορφές, στον άνθρωπο, λόγω εναλλακτικού ματίσματος.
Οι λειτουργίες της ποικίλλουν και είναι κυρίως ρυθμιστικές καθώς δρα ως μεταγραφικός καταστολέας, ρυθμίζει το μάτισμα και το μεταβολισμό του RNA σε καταστάσεις απόκρισης στο στρες το οποίο επιτυγχάνεται με την ικανότητα πρόσδεσης της σε μονόκλωνες είτε δίκλωνες αλληλουχίες DNA/RNA που περιέχουν GT/GU επαναλήψεις. Η πρωτεΐνη TDP-43 εμπλέκεται στην εμφάνιση νευροεκφυλιστικών νόσων (κυρίως ALS και FTD) και αποτελεί κύριο συστατικό των ουβικιτίνης θετικών συσσωματωμάτων που εντοπίζονται στο κυτταρόπλασμα (σε μορφή συνήθως CTF-25 kDa). Η TDP-43 είναι μια hn-RNP πρωτεΐνη η οποία αποτελείται από δύο μοτίβα αναγνώρισης RNA (RRMs) ακολουθούμενα από μια πλούσια σε γλυκίνη καρβοξυτελική περιοχή.
Ο σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη καινοτόμου, ταχείας και αξιόπιστης μεθοδολογίας για την ανίχνευση της σημειακής (SNP) παραλλαγής p.Ile383Val (rs80356740, c.1147A>G, MAF:0,002% EXAc) του γονιδίου TARDBP και η αξιολόγηση της σε Έλληνες FTD ασθενείς, ώστε να προσδιοριστεί εάν η παραλλαγή αυτή αποτελεί ιδρυτική μετάλλαξη για τον Ελληνικό FTD πληθυσμό.
Ασθενείς και μέθοδοι: Απομονώθηκε γενωμικό DNA από το περιφερικό αίμα συνολικά 133 Ελλήνων FTD ασθενών, ύστερα από ενημέρωση και ενυπόγραφη συγκατάθεση τους καθώς και 60 δείγματα υγιών (όλοι εξετάστηκαν από την Β’ Νευρολογική Κλινική του Αττικού Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου). Σχεδιάστηκε μια μεθοδολογία Real-Time qPCR στη πλατφόρμα του LightCycler με τη χρήση ειδικών για την παραλλαγή ανιχνευτών και στην συνέχεια ανάλυση καμπύλης τήξεως. Η επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων έγινε σε επιλεγμένα δείγματα με την μέθοδο DNA αλληλούχισης κατά Sanger, με τη μέθοδο θερμικών κύκλων BigDye Terminator v1.1 στο γενετικό αναλυτή ΑΒΙ310. Στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν προγράμματα βιοπληροφορικής για την αξιολόγηση της παραλλαγής και πιθανώς τον χαρακτηρισμό της ως παθογνωμική ή όχι.
Αποτελέσματα: Η μεθοδολογία ήταν ταχεία και αξιόπιστη επιδεικνύοντας άριστη PCR απόδοση (Ε=2,06) και αναπαραγωγιμότητα (Cq CV%<3,5%) καθώς και ειδικότητα στην γονοτύπηση (Tm A αλληλίου 55,26 ℃ και του G αλληλίου 65,82 ℃, ΔΤm= 9,61℃, CV%< 2,5%). Με βάση την ανάλυση των καμπυλών τήξης της μεθόδου Real-Time qPCR έγινε αξιόπιστη ανίχνευση της παραλλαγής p.Ile383Val του γονιδίου TARDBP σε 5 από τους 133 ασθενείς FTD σε ετεροζυγωτία ενώ βρέθηκε και σε 1 δείγμα ελέγχου (στα 60). Τα αποτελέσματα των προγραμμάτων βιοπληροφορικής ήταν αμφιλεγόμενα καθώς τα προγράμματα SIFT, Poly-Phen2 και AlignGVGD χαρακτηρίζουν την παραλλαγή ως μη-επιβλαβή ενώ τα PhyloP, PhastCons και Mutation Taster την χαρακτηρίζουν ως υψηλά συντηρημένη και συνεπώς παθογόνο.
Συμπεράσματα: Καθώς από τους 5 ασθενείς που βρέθηκαν θετικοί για την παραλλαγή, οι 3 εμφάνιζαν κλινικό φαινότυπο FTD-SD (σημασιολογικής μορφής PPA), ο ένας συμπεριφορικής FTD (bvFTD) και μια ασθενής FTD με συμπτώματα που εμπίπτουν σε όλες τις κατηγορίες, πιθανόν να σχετίζεται η συγκεκριμένη παραλλαγή με την εμφάνιση του συγκεκριμένου υποτύπου FTD-SD. Οι 4 από τους 5 ασθενείς είναι άρρενες οπότε εγείρεται το ερώτημα εάν το φύλο αποτελεί καθοριστικής σημασίας παράγοντα. Ο αριθμός των δειγμάτων είναι περιοριστικός ώστε να μπορέσει να χαρακτηριστεί με βεβαιότητα η παραλλαγή ως μετάλλαξη ωστόσο υπάρχει μια ισχυρή ένδειξη αφού η συχνότητα εμφάνισης του αλληλομόρφου αγγίζει μόλις το 0,002% στο γενικό Ευρωπαϊκό πληθυσμό ενώ φτάνει το 3,76% στους Έλληνες FTD ασθενείς που ελέγχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, μια αξιοσημείωτη αύξηση. Απαιτούνται περαιτέρω λειτουργικές μελέτες για το χαρακτηρισμό της παραλλαγής ως παθογνωμικής μετάλλαξης.
Λέξεις-κλειδιά:
Μετωποκροταφική άνοια, παραλλαγή, TARDBP, p.Ile383Val
