Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Γρηγόριος Καλτσάς, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ, Επιβλέπων
Μιχαήλ Βουλγαρέλης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Νικόλαος Σύψας, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ευανθία Κασσή, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Ευσταθία Καψογεώργου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Αθανάσιος Πρωτογέρου, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Σταύρος Σουγιουλτζής, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
O καρκίνος του θυρεοειδούς αποτελεί την πιο συχνή ενδοκρινική κακοήθεια. Ο καρκίνος του θυρεοειδή μπορεί να κατηγοριοποιηθεί σε ξεχωριστές ιστολογικές οντότητες, το διαφοροποιημένο, το μυελοειδή και τον αναπλαστικό, που η καθεμία έχει διαφορετική πρόγνωση. Τη χειρότερη πρόγνωση παρουσιάζει ο αναπλαστικός καρκίνος, ενώ ο διαφοροποιημένος (συνήθως) έχει εξαιρετική πρόγνωση. Είναι γεγονός ότι η επίπτωση του καρκίνου του θυρεοειδή αυξάνεται συνεχώς, ενώ αύξηση παρουσιάζουν και οι πιο επιθετικοί όγκοι. Για το λόγο αυτό είναι αναγκαία η ανακάλυψη καινούριων θεραπειών.
Η Μετφορμίνη είναι το πιο συχνά συνταγογραφούμενο αντιδιαβητικό φάρμακο, και την τελευταία δεκαετία έχουν δημοσιευτεί πολλές μελέτες για την αντικαρκινική της δράση. Διάφορες αναδρομικές μελέτες ανέφεραν ότι οι διαβητικοί ασθενείς που λαμβάνουν θεραπεία με Μετφορμίνη έχουν καλύτερα αποτελέσματα όσον αφορά στην πρόληψη και την καταπολέμηση διαφόρων ειδών καρκίνου. Έρευνες που έγιναν in vitro μελέτησαν τον αντικαρκινικό μηχανισμό δράσης της Μετφορμίνης, και ανέφεραν ότι κυρίως βασιζόταν στην αύξηση της έκφρασης του AMPK, που είναι ο συντονιστής ενέργειας του κυττάρου, και την αναστολή του mTOR. Κάποιες προκαταρκτικές μελέτες στο εργαστήριό μας έδειξαν ότι η Μετφορμίνη ήταν αποτελεσματική εναντίον του καρκίνου του θυρεοειδούς. Ωστόσο, η μεγαλύτερη κριτική όλων των in vitro μελετών για τη Μετφορμίνη ήταν ότι χρησιμοποιούνταν πολύ υψηλές δόσεις (mM) που δεν ήταν κλινικά επιτεύξιμες στον ανθρώπινο οργανισμό (όπου η μέγιστη συγκέντρωση είναι 50-100 μΜ). Για αυτό το λόγο, στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η εξερεύνηση μεθόδων για την αύξηση της αποτελεσματικότητας της Μετφορμίνης in vitro.
Αρχικά, προσπαθήσαμε να τροποποιήσουμε το μεταφορέα της Μετφορμίνης OCT1 για να αυξήσουμε την ενδοκυττάρια μεταφορά του φαρμάκου. Παρά την ανίχνευση του μεταφορέα, δε βρέθηκαν σημαντικές διαφορές στα παθολοανατομικά χαρακτηριστικά των ασθενών που εξετάστηκαν, και γι’αυτό το λόγο δεν προχωρήσαμε στη φαρμακολογική στόχευση του OCT1. Το επόμενο βήμα ήταν η στόχευση του μεταβολισμού των κυττάρων, και πιο συγκεκριμένα το μικροπεριβάλλον και η συγκέντρωση γλυκόζης στο μέσο. Τα αρχικά πειράματα έδειξαν ότι η Μετφορμίνη σε συνθήκες χαμηλής γλυκόζης 5 mM (που αντιστοιχούν σε νορμογλυκαιμικές συνθήκες στον άνθρωπο 100 mg/dl) προκάλεσε όχι μόνο αναστολή του πολλαπλασιασμού των θυρεοειδικών καρκινικών σειρών, αλλά και εμφανή κυτταρικό θάνατο. H ενεργοποίηση της αυτοφαγίας δεν ήταν επαρκής για να εξηγήσει το φαινόμενο, και ως εκ τούτου, ανακαλύφθηκε ένα σπάνιο είδος κυτταρικού θανάτου, η όγκωση. Η όγκωση είναι μία πολυεπίπεδη διαδικασία κυτταρικού θανάτου, το χαρακτηριστικό της οποίας είναι το κυτταρικό οίδημα, και εφόσον δεν αντιστραφεί η διαδικασία με χορήγηση γλυκόζης, η διάλυση της κυτταρικής μεμβράνης και η νέκρωση. Κεντρικό ρόλο στην όγκωση βρέθηκε ότι παίζει η εξάντληση του ΑΤΡ, και όπως δείξαμε στην έρευνά μας η ενεργοποίηση του ΑΜΡΚ, γεγονός που ενισχύει την υπάρχουσα αντίληψη ότι η Μετφορμίνη ασκεί πολλές από τις δράσεις μέσω του μεταβολισμού των κυττάρων.
Έχοντας δείξει ότι η μειωμένη γλυκόζη αυξάνει την αποτελεσματικότηττα της Μετφορμίνης, στη συνέχεια αποδείξαμε ότι η ολική στέρηση γλυκόζης μπορεί να παρουσιάσει ακόμα πιο εντυπωσιακά αποτελέσματα. Στη συνέχεια, στραφήκαμε στο μοριακό μηχανισμό δράσης της Μετφορμίνης, που ως γνωστόν είναι ένας αναστολέας του συμπλέγματος Ι της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας. Συνδυάσαμε, λοιπόν, τη Μετφορμίνη με έναν αναστολέα της γλυκόλυσης (2-deoxy-glucose/2-DG) και δείξαμε ότι ο θεραπευτικός συνδυασμός μπορεί να αυξήσει κατακόρυφα την αποτελεσματικότητα της Μετφορμίνης. Σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης γλυκόζης, ο θεραπευτικός συνδυασμός (25 μΜ Μετφορμίνης και 5mM 2DG) προκάλεσε αποπτωτικό θάνατο στα θυρεοειδικά καρκινικά κύτταρα, αποδεικνύοντας ότι η Μετφορμίνη μπορεί να είναι αποτελεσματική σε συγκεντρώσεις που είναι κλινικά επιτεύξιμες στον άνθρωπο.
Στη συνέχεια παραγματοποιήσαμε μέσω qRT-PCR και ανοσοϊστοχημείας έναν έλεγχο για να εντοπίσουμε ποια μεταβολικά ένζυμα εμπλέκονται στον καρκίνο του θυρεοειδούς. Η Πυροσταφυλική Κινάση (PKM) επιλέχθηκε μέσω του screening, και περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι η έκφραση του ΡΚΜ2 μειώνεται σημαντικά μετά από θεραπεία με Μετφορμίνη σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης γλυκόζης. Τα αποτελέσματα αυτά σε συνδυασμό με την ανοσοϊστοχημεία που έδειξε αυξημένη έκφραση του ΡΚΜ2 σε επιθετικούς καρκίνους του θυρεοειδούς, μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι το ΡΚΜ2 μπορεί να χρησιμοποιηθεί δυνητικά ως ένας δείκτης για την απόκριση στη θεραπεία με Μετφορμίνη ασθενών με καρκίνο του θυρεοειδούς.
Στα πειράματα που πραγματοποιήσαμε με τη Μετφορμίνη, ανακαλύψαμε ότι τα μιτοχόνδρια και συγκεκριμένα η κυτοχρωμική c οξειδάση παίζει σημαίνοντα ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του θυρεοειδούς. Η Μετφορμίνη ως μεταβολικό φάρμακο επηρεάζει τη μιτοχονδριακή ισορροπία, αλλά επίσης στραφήκαμε σε ένα πιο ειδικό αναστολέα της κυτοχρωμικής c οξειδάσης. Η Μιτοτάνη είναι ένας παράγοντας που χρησιμοποιείται για τη θεραπεία του καρκίνου των επινεφριδίων. Μέχρι πρόσφατα δεν ήταν ξεκάθαρος ο μηχανισμός δράσης της, αλλά πρόσφατες έρευνες έδειξαν ότι μοριακός στόχος της είναι η υπομονάδα 4 της κυτοχρωμικής c οξειδάσης (COX4). Για το λόγο αυτό προχωρήσαμε σε πειράματα με Μιτοτάνη.
Αρχικά δείξαμε ότι η Μιτοτάνη είναι κυτταροτοξική εναντίον των θυρεοειδικών καρκινικών σειρών που προέρχονται από όλους τους ιστολογικούς τύπους (ΔΚΘ, ΜΚΘ, ΑΚΘ). Η Μιτοτάνη ήταν πιο αποτελεσματική εναντίον των κυττάρων που φέρουν τη μετάλλαξη BRAFV600E (BCPAP και SW1736) και των κυττάρων που προέρχονται από ΜΚΘ (ΤΤ). Κυτταρομετρία ροής των κυττάρων έδειξε ότι η Μιτοτάνη προκάλεσε απόπτωση στα θυρεοειδικά καρκινικά κύτταρα. Ο μηχανισμός δράσης εικάζουμε ότι σχετίζεται με την πρόκληση ενδοκυττάριου stress, όπως φάνηκε από τα πειράματα που πραγματοποιήσαμε.
Στη συνέχεια εξετάσαμε τη μιτοχονδριακή αλυσίδα, και δείξαμε ότι η θεραπεία με Μιτοτάνη μειώνει το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεβράνης καθώς και προκαλεί μεταβολές στην έκφραση των ενζύμων της μιτοχονδριακής μεμβράνης, με κυριότερη τη μείωση της έκφρασης του ΑΤΡ5Β. Τέλος σε πειράματα ανοσοϊστοχημείας δείξαμε την έκφραση του ΑΤΡ5Β σε καρκίνους του θυρεοειδούς από όλους τους ιστολογικούς τύπους, με το ΜΚΘ να παρουσιάζει την υψηλότερη έκφραση, γεγονός που επιβεβαιώνει τη μεγαλύτερη εξάρτηση των μυελοειδών κυττάρων από τα μιτοχόνδρια, όπως είχε φανεί και στα in vitro πειράματα με τα ΤΤ κύτταρα. Φυσικά, η τοξικότητα της Μιτοτάνης περιορίζει τη χρήση της, αλλά σε πειράματα που πραγματοποιήσαμε, η Μιτοτάνη ήταν πιο τοξική για τα θυρεοειδικά καρκινικά κύτταρα παρά για τους ανθρώπινους ινοβλάστες.
Συμπερασματικά, η διδακτορική διατριβή έδειξε ότι η Μετφορμίνη μπορεί να χρησιμοποιηθεί στη μάχη εναντίον του καρκίνου του θυρεοειδούς, και ότι είναι πιο αποτελεσματική σε συνθήκες νορμό- ή/και υπό-γλυκαιμίας. Το γεγονός ότι η Μετφορμίνη προκαλεί κυτταρικό θάνατο μέσω της όγκωσης και ότι μπορεί να συνδυαστεί με άλλα μεταβολικά φάρμακα για την αύξηση της αποτελεσματικότητάς της είναι σίγουρα πολύ ενθαρρυντικό και το επόμενο βήμα θα είναι κλινικές μελέτες για την εφαρμογή σε ασθενείς. Παρομοίως, η Μιτοτάνη φάνηκε στην προκλινική μελέτη μας ότι είναι αποτελεσματική εναντίον των θυρεοειδικών καρκινικών κυττάρων, και αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να αποτελέσουν τη βάση για κλινικές μελέτες σε ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του θυρεοειδούς.
