Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
Κωνσταντίνος Κωνσταντόπουλος, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Παναγιώτης Παναγιωτίδης, Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Μαρία Αγγελοπούλου, Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Θεόδωρος Βασιλακόπουλος,Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Μαρίνα Σιακαντάρη, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Φλώρα Κοντοπίδου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Στυλιανή Κοκόρη, Επίκουρη Καθηγήτρια, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Εισαγωγή: Η ταχεία και ολοκληρωμένη αιματολογική αποκατάσταση, έπειτα από την αυτόλογη μεταμόσχευση (ΑΜΜΟ) κινητοποιημένων αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων (ΑΑΚ), αποτελεί δείκτη ποιότητας τόσο του κλινικού όσο και του εργαστηριακού τμήματος μιας μονάδας μεταμόσχευσης. Η ελάττωση της βιωσιμότητας των κρυοσυντηρημένων μοσχευμάτων επιβάλλει μια σταθερή πρακτική ελέγχου της βιωσιμότητας, με αποτελέσματα που σχετίζονται σταθερά με την κινητική της αιματολογικής αποκατάστασης των ασθενών.
Σκοπός: Σκοπός της μελέτης ήταν α) η διερεύνηση της επίδρασης της κρυοσυντήρησης στη βιωσιμότητα και την απόπτωση των CD34+ κυττάρων και της επίδρασης τους στην κινητική της μετέπειτα αιματολογικής αποκατάστασης, β) η διάκριση της ασφαλέστερης μεθόδου προσδιορισμού της βιωσιμότητας και της «πραγματικής» βιωσιμότητας των CD34+ κυττάρων μεταξύ των δυο πιο ευρέως χρησιμοποιούμενων μεθόδων, και γ) ο προσδιορισμός της ελάχιστης δόσης βιώσιμων και βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+ κυττάρων για ιδανική αιματολογική αποκατάσταση μετά την ΑΜΜΟ.
Μέθοδοι: Μελετήθηκαν αναδρομικά τα κρυοσυντηρημένα δείγματα 61 ασθενών με αιματολογικές κακοήθειες – Πολλαπλό Μυέλωμα (MM), Λέμφωμα Hodgkin (HL) και Μη-Hodgkin Λεμφώματα (NHL) - που είχαν ήδη υποβληθεί σε ΑΜΜΟ.
Ως προς την κυτταρική τους βιωσιμότητα, τα δείγματα αναλύθηκαν με δύο μεθόδους: α) τη μέθοδο με χρώση με Trypan Blue (ΤΒ) και β) με κυτταρομετρία ροής (FACS). Η ταυτόχρονη χρησιμοποίηση της χρωστικής 7-AAD και της Annexin-V επέτρεψε τη διάκριση μεταξύ βιώσιμων (7-AAD-/Annexin-V-), πρώιμων αποπτωτικών (7-AAD-/Annexin-V+) και νεκρών κυττάρων (7-AAD+/Annexin-V+). Τα βιώσιμα κύτταρα δε βάφονται από τη χρωστική Trypan Blue (μέθοδος α) και είναι αρνητικά στη 7-AAD (method β). τα «πραγματικά» βιώσιμα (βιώσιμα μη αποπτωτικά κύτταρα είναι αρνητικά τόσο στη 7-ADD όσο και στην Annexin-V.
Ως προς την επίδρασή τους στη βιωσιμότητα και την «πραγματική βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων, μελετήθηκαν με μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση, τα χαρακτηριστικά των ασθενών, οι παράμετροι της κινητοποίησης, και τα χαρακτηριστικά των κρυοκατεψυγμένων προϊόντων (Πίνακας 1). Ως προς την κινητική της αιματολογικής αποκατάστασης των ασθενών μετά την ΑΜΜΟ, μελετήθηκαν με μονοπαραγοντική ανάλυση, τα εξής χαρακτηριστικά: το φύλο, η ηλικία, τα νόσημα, η κατάσταση νόσου κατά τη συλλογή ΑΑΚ, η μεγαθεραπεία, η κινητική της κινητοποίησης, ο συνολικός όγκος του αποψυγμένου προϊόντος, ο αριθμός των ασκών, τα CD34+/Kg ανά ασκό, η διάρκεια κρυοσυντήρησης, ο συνολικός αριθμός CD34+/kg (όπως μετρήθηκαν στο φρέσκο προϊόν) και ο συνολικός αριθμός βιώσιμων και βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg, που εγχύθηκαν. Κατά τη μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση, η βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων περιφερικού αίματος την ημέρα της συλλογής, η βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων στο προϊόν της συλλογής και η συγκέντρωση των PLT στον ασκό, προστέθηκαν στους παραπάνω παράγοντες ως πιθανοί προγνωστικοί παράγοντες ιδανικής αιματολογικής αποκατάστασης.
Ως «προγραμματισμένη» δόση ορίστηκε ο προς έγχυση αριθμός των CD34+/Kg, όπως μετράται στο φρέσκο προϊόν συλλογής. Η ημέρα βραχυπρόθεσμης αποκατάστασης είναι η πρώτη ημέρα μετά την ΑΜΜΟ, όπου τα ουδετερόφιλα είναι ≥500/μl και η πρώτη ημέρα μετά από τρείς συνεχόμενες (χωρίς μετάγγιση) όπου τα αιμοπετάλια είναι ≥20×103/μl. Μακροπρόθεσμη αποκατάσταση επιτυγχάνεται εφόσον τα ουδετερόφιλα είναι ≥1500/μl (το αργότερο έως τη D90) και ≥2000/μl (το αργότερο έως τη D180) και τα αιμοπετάλια είναι ≥140×103/μl (το αργότερο έως τη D180). Ως ιδανική θεωρήθηκε η αιματολογική αποκατάσταση, στους ασθενείς που ο αριθμός των ουδετερόφιλων ήταν ≥500/μl μέχρι τη D12 και ≥1500/μl έως τη D30, ενώ ταυτόχρονα, ο αριθμός των αιμοπεταλίων ήταν ≥20x103/μl μέχρι την D14 και ≥140x103/μl το αργότερο έως τη D90.
Αποτελέσματα: Στα 61 δείγματα που αναλύθηκαν, η διάμεση τιμή α) των ζώντων εμπύρηνων κυττάρων (TNC) ήταν 55,3% (εύρος 10-73%, μέτρηση με Trypan blue), β) των βιώσιμων CD45+ κυττάρων ήταν 61,7% (εύρος 7,5-81,4%, μέτρηση με FACS), γ) των βιώσιμων CD34+ κυττάρων ήταν 45,9% (εύρος 0,6-88%), δ) των αποπτωτικών CD45+ κυττάρων ήταν 8,4% (εύρος 0,5-34,3%), ε) των αποπτωτικών CD34+ κυττάρων ήταν 4,3% (εύρος 0-44,9%), στ) των βιώσιμων μη αποπτωτικών CD45+ κυττάρων ήταν 52,9% (εύρος 5,4-80,9%) και ζ) των βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+ κυττάρων ήταν 32,2% (εύρος 0,5-79,5%). Τα κρυοσυντηρημένα CD34+ κύτταρα είχαν στατιστικά σημαντική μειωμένη βιωσιμότητα έναντι των CD45+ κυττάρων (διάμεση διαφορά -12,6%, p<0,0005). Η μέθοδος με ΤΒ υπερεκτίμησε την % βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων στο 70,3% των δειγμάτων της μελέτης.
Ως προς τη βιωσιμότητα και την «πραγματική» βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων, εννέα παράγοντες βρέθηκαν στατιστικά σημαντικοί κατά τη μονοπαραγοντική ανάλυση (πίνακας 1). Κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση μόνο οι εξής τρεις παρέμειναν στατιστικά σημαντικοί: α) η βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων του περιφερικού αίματος την ημέρα της συλλογής (p=0,020 για τη βιωσιμότητα και p=0,036, για την «πραγματική» βιωσιμότητα), β) η βιωσιμότητα των CD34+ κυττάρων στο φρέσκο προϊόν συλλογής (p=0,024 και p=0,006, αντίστοιχα) και γ) η τελική συγκέντρωση των PLT στον ασκό κρυοκατάψυξης (p=0,001 και p=0,004, αντίστοιχα).
Όσο αφορά στην αιματολογική αποκατάσταση των ασθενών μετά την ΑΜΜΟ, κατά τη μελέτη της επίδρασης χαρακτηριστικών των ασθενών και του μοσχεύματος, με μονοπαραγοντική ανάλυση, διαπιστώθηκε ότι με στατιστικά σημαντικό τρόπο: α) η ηλικία >53 ετών σχετίζεται με πιο αργή αποκατάσταση της ουδετεροπενίας {D11 έναντι D10} και της θρομβοπενίας {D14 έναντι D13} και με υστέρηση στη μακροπρόθεσμη αποκατάσταση των αιμοπεταλίων {το 66,7% των ασθενών >53 ετών έναντι του 90,3% των ≤53 ετών}, β) στους ασθενείς με ΜΜ η αποκατάσταση της ουδετεροπενίας καθυστερεί περισσότερο {D11 (MM) έναντι D9 (LH) και D10 (NHL)}, ενώ στους ασθενείς με LH η αποκατάσταση της θρομβοπενίας είναι πιο ταχεία {D11 (LH), έναντι D14 (MM), και D15 (NHL)}, γ) οι πολύ καλοί κινητοποιητές σχετίζονται με ταχύτερη βραχυπρόθεσμη {D12 (πολύ καλοί) D14 (καλοί) και D15 (πτωχοί)} και μακροπρόθεσμη αποκατάσταση των αιμοπεταλίων {το 96.6% των πολύ καλών έναντι του 62.5% των υπολοίπων} γ) η έγχυση >360ml κυτταρικού προϊόντος σχετίζεται με καθυστέρηση της αποκατάστασης των αιμοπεταλίων τόσο βραχυπρόθεσμα {D13 έναντι D15} όσο και μακροπρόθεσμα {το 56% έναντι του 94,4% αυτών που έλαβαν ≤360ml}, δ) η έγχυση >3 ασκών κυτταρικού προϊόντος σχετίζεται με υστέρηση στη μακροπρόθεσμη αποκατάσταση των αιμοπεταλίων {το 56,3% έναντι του 86,7% όσων έλαβαν ≤3}, και ε) η έγχυση ≤2,4×106/Kg CD34+ κυττάρων ανά ασκό σχετίζεται με καθυστέρηση της βραχυπρόθεσμης αποκατάστασης των αιμοπεταλίων {D15 έναντι D12} και με υστέρηση στη μακροπρόθεσμη αιματολογική αποκατάσταση {το 62,1% έναντι 93,8% του όσων έλαβαν>2,4×106/Kg ανά ασκό}, στ) η «προγραμματισμένη» δόση CD34+/Kg, σχετίζεται σημαντικά μόνο με τη βραχυπρόθεσμη αποκατάσταση των αιμοπεταλίων {D18 (για <3×106), D15 (για 3-6×106) και D13 (για >6×106}, ζ) η δόση των βιώσιμων και βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg, που εγχύεται στην ΑΜΜΟ, έχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση τόσο με τη βραχυπρόθεσμη όσο και με τη μακροπρόθεσμη αιματολογική αποκατάσταση.
Iδανική αιματολογική αποκατάσταση - όπως ορίστηκε στις μεθόδους -, είχαν 32 ασθενείς (το 52,5%). Κατά τη μονοπαραγοντική ανάλυση διαπιστώθηκαν οι παρακάτω παράμετροι ως στατιστικά σημαντικές για την επίτευξη ιδανικής αιματολογικής αποκατάστασης: η ηλικία, το νόσημα, η κινητική της κινητοποίησης, η βιωσιμότητα CD34+ κυττάρων περιφερικού αίματος την ημέρα της συλλογής, η βιωσιμότητα CD34+ κυττάρων στο προϊόν της συλλογής, ο συνολικός όγκος αποψυγμένου προϊόντος, ο αριθμός των CD34+/Kg ανά ασκό, η τελική συγκέντρωση των PLT στον ασκό και η δόση των βιώσιμων και των βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg που εγχύθηκαν. Κατά την πολυπαραγοντική ανάλυση δε, μόνο η αύξηση της δόσης των βιώσιμων ή των βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg που εγχύθηκαν, σχετίστηκε και με στατιστικά και με κλινικά σημαντική αύξηση της πιθανότητας για ιδανική αιμοποιητική αποκατάσταση. Ως βέλτιστη ελάχιστη δόση για την επίτευξη ιδανικής αιματολογικής αποκατάστασης, βρέθηκαν τα 6,9x106 CD34+/Kg (μέτρηση στο φρέσκο προϊόν), τα 3,4x106 βιώσιμων CD34+/Kg και τα 2,9x106 βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg.
H μείωση των βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+ κυττάρων στα κρυοκατεψυγμένα προϊόντα είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική διαφοροποίηση των «πραγματικών» δόσεων των ΑΑΚ, που χορηγήθηκαν στην ΑΜΜΟ, σε σχέση με τις «προγραμματισμένες» δόσεις. Αναλυτικά, οι ασθενείς με «προγραμματισμένη» δόση CD34+/Kg: α) <3x106 έλαβαν τελικά 0,9x106 βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg (διάμεση τιμή), β) 3-6x106 έλαβαν τελικά 1,1x106 CD34+/Kg και γ) >6x106 CD34+/Kg έλαβαν τελικά 3,1x106 CD34+/Kg.
Συμπεράσματα:
Η στατιστικά σημαντική συσχέτιση χαρακτηριστικών του ασθενή και του κρυοσυντηρημένου προϊόντος με τη βιωσιμότητα των αποψυγμένων CD34+ κυττάρων, δικαιολογεί σε μεγάλο βαθμό τη διακύμανση των ποσοστών βιωσιμότητας, που παρατηρήθηκε μεταξύ των δειγμάτων, και είναι σημαντικό να λαμβάνονται υπόψη κατά το σχεδιασμό της κρυοκατάψυξης (αραίωση και διανομή του προϊόντος σε ασκούς). Επιπλέον, «προγνωστικοί δείκτες βιωσιμότητας», γνωστοί πριν, κατά και μετά τη συλλογή των ΑΑΚ, μπορούν να κατευθύνουν την απόφαση για συλλογή επιπλέον CD34+/Kg ή για έλεγχο της βιωσιμότητας του μοσχεύματος πριν τη ΑΜΜΟ. Η ταχεία και ολοκληρωμένη αιματολογική αποκατάσταση στην ΑΜΜΟ επηρεάζεται επίσης στατιστικά σημαντικά από χαρακτηριστικά των ασθενών και του μοσχεύματος. Ο αριθμός των CD34+/Kg, όπως μετράται στο φρέσκο προϊόν συλλογής, σχετίζεται στατιστικά σημαντικά μόνο με την ημέρα βραχυπρόθεσμης αποκατάστασης των αιμοπεταλίων. Αντίθετα, ο αριθμός των βιώσιμων και βιώσιμων μη αποπτωτικών CD34+/Kg που εγχύεται στην ΑΜΜΟ, έχει στατιστικά σημαντική συσχέτιση τόσο με τη βραχυπρόθεσμη όσο και με τη μακροπρόθεσμη αιματολογική αποκατάσταση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση κατέδειξε μόνο τον αριθμό των βιώσιμων ή των βιώσιμων μη αποπτωτικών κυττάρων/Kg ως στατιστικά και κλινικά σημαντική παράμετρο για την επίτευξη ιδανικής αιματολογικής αποκατάστασης. Επομένως, είναι προτιμότερο, η συλλογή των CD34+ κυττάρων να στοχεύει στον αριθμό που εξασφαλίζει ιδανική αιματολογική αποκατάσταση, o οποίος αντιπροσωπεύεται ακριβέστερα από τα βιώσιμα μη αποπτωτικά CD34+ κύτταρα παρά από τον αριθμό των Cd34+ κυττάρων που μετράται στο φρέσκο προϊόν. Ο έλεγχος της βιωσιμότητας του προς έγχυση κρυοσυντηρημένου προϊόντος δεν είναι απαραίτητος υπό ιδανικές συνθήκες κρυοσυντήρησης και απόψυξης. Είναι όμως δόκιμος όταν ο αριθμός των βιώσιμων CD34+/Kg προβλέπεται χαμηλότερος από τον ελάχιστο απαιτούμενο για ιδανική αιματολογική αποκατάσταση, βάση της βιωσιμότητας των CD34+ κυττάρων του περιφερικού αίματος την ημέρα της συλλογής, της βιωσιμότητας των CD34+ κυττάρων στο φρέσκο προϊόν συλλογής και της τελικής συγκέντρωσης των PLT στον ασκό κρυοκατάψυξης.
Καθώς η απόπτωση των κρυοσυντηρημένων CD34+ κυττάρων οδηγεί σε επιπλέον μείωση της δόσης των CD34+/Kg, ενώ σε μπορεί να προβλεφθεί, πρέπει να συνεκτιμάται κατά την αξιολόγηση του προϊόντος. Ο έλεγχος της βιωσιμότητας με τη μέθοδο με Trypan blue, προτείνεται μόνο ως μια ταχεία λύση σε ένα πρωταρχικό στάδιο ελέγχου, ενώ είναι ασφαλέστερο να συνοδεύεται με κυτταρομετρία ροής, ιδιαίτερα στις συλλογές με χαμηλό αριθμό CD34+/Kg.
