Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Αντώνιος Χατζηγεωργίου, Αναπληρωτής Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ, Επιβλέπων
Δημήτρης Κλέτσας, Ερευνητής Α', Διευθυντής Ινστιτούτου Βιοεπιστημών και Εφαρμογών, ΕΚΕΦΕ «Δημόκριτος»
Μιχαήλ Κουτσιλιέρης, Ομότιμος Καθηγητής, Ιατρική Σχολή, ΕΚΠΑ
Περίληψη:
Ο μεσοσπονδύλιος δίσκος είναι μια ελαστική χόνδρινη δομή που παρεμβάλλεται μεταξύ διαδοχικών σπονδύλων και αποτελεί την άρθρωση της σπονδυλικής στήλης. Κάθε μεσοσπονδύλιος δίσκος αποτελείται από τον εσωτερικό πηκτοειδή πυρήνα (NP) και τον εξωτερικό ινώδη δακτύλιο (AF) που τον περιβάλλει. Τα κύτταρα του μεσοσπονδύλιου δίσκου είναι υπεύθυνα για την παραγωγή και την αποικοδόμηση των συστατικών της εξωκυττάριας μήτρας, της οποίας ο κύριος ρόλος είναι η παροχή στήριξης και αντοχής, αλλά και η προστασία της δομής του μεσοσπονδύλιου δίσκου.
Κατά την εκφύλιση του μεσοσπονδύλιου δίσκου συμβαίνουν αλλαγές στη σύσταση, στη δομή και στη βιοχημεία του. Τα όρια μεταξύ του ινώδους δακτυλίου και του πηκτοειδούς πυρήνα δεν είναι πλέον ευκρινή, η ομοιοστασία της εξωκυττάριας μήτρας διαταράσσεται και το ποσοστό των γηρασμένων κυττάρων - τα οποία χαρακτηρίζονται από έναν εκκριτικό φαινότυπο που σχετίζεται με τη γήρανση (SASP) - αυξάνεται. Η εκφύλιση του μεσοσπονδύλιου δίσκου είναι μια ηλικιοεξαρτώμενη και πολυπαραγοντική πάθηση. Μία από τις αιτίες πρόκλησής της είναι η μη αναστρέψιμη απώλεια οιστρογόνων που λαμβάνει χώρα κατά την εμμηνόπαυση στις γυναίκες. Η έλλειψη της 17β-οιστραδιόλης έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση MMPs στην εξωκυττάρια μήτρα του μεσοσπονδύλιου δίσκου, την εμφάνιση οξειδωτικού στρες και φλεγμονής. Μελέτες που έχουν πραγματοποιηθεί σε κύτταρα ινώδους δακτυλίου και πηκτοειδούς πυρήνα έχουν δείξει πως η εξωγενής χορήγηση 17β-οιστραδιόλης μειώνει τις εκφυλιστικές αλλαγές που υφίσταται ο μεσοσπονδύλιος δίσκος. Από την άλλη, τα γηρασμένα κύτταρα, τα οποία έχει δειχθεί ότι συσσωρεύονται σε μεγάλο ποσοστό στο μεσοσπονδύλιο δίσκο, οδηγούν επίσης σε αυξημένη έκφραση και ενεργότητα των MMPs, στην εμφάνιση οξειδωτικού στρες και φλεγμονής. Για τους παραπάνω λόγους, σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων οιστρογόνων, με έμφαση στον υποδοχέα οιστρογόνων GPER σε νεαρά και γηρασμένα κύτταρα μεσοσπονδύλιου δίσκου, καθώς και η διερεύνηση της πιθανής θετικής επίδρασης της εξωγενούς χορήγησης 17β-οιστραδιόλης στα κύτταρα αυτά.
Αρχικά, μελετήθηκε η πρωτεϊνική έκφραση των οιστρογονικών υποδοχέων ERα, ERβ και GPER σε νεαρά κύτταρα ινώδους δακτυλίου και πηκτοειδούς πυρήνα, τα οποία καλλιεργήθηκαν σε δύο είδη θρεπτικού υλικού, σε κλασικό θρεπτικό υλικό DMEM 10% (v/v) FBS και σε DMEM χωρίς ερυθρό της φαινόλης 10% (v/v) FBS-DCT (Dextran/Charcoal Treated), από το οποίο απουσιάζουν τα οιστρογόνα. Η ανάλυση western δεν υπέδειξε κάποια διαφορά στην έκφραση των υποδοχέων που να οφείλεται στα διαφορετικά είδη θρεπτικού υλικού. Επίσης, η έκφραση του υποδοχέα ERα δεν ήταν ανιχνεύσιμη στα κύτταρα αυτά, ενώ τα επίπεδα έκφρασης των ERβ και GPER ήταν ανιχνεύσιμα, τόσο στα κύτταρα ινώδους δακτυλίου, όσο και στα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα. Δεδομένου ότι ο ERβ είναι επαρκώς μελετημένος, για περαιτέρω μελέτη επιλέχθηκε ο υποδοχέας οιστρογόνων GPER, για τον οποίο δεν υπάρχουν επαρκή δεδομένα όσον αφορά το ρόλο του στην εκφύλιση του μεσοσπονδύλιου δίσκου.
Στη συνέχεια, κύτταρα ινώδους δακτυλίου οδηγήθηκαν σε κυτταρική γήρανση μέσω έκθεσης σε γ-ακτινοβολία, όπως επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο ενσωμάτωσης BrdU, τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης των βιοδεικτών p16INK4α και p21WAF1 και τη θετική ειδική για τη γήρανση χρώση SA-β-Gal. Έπειτα, σε βόεια νεαρά και γηρασμένα κύτταρα ινώδους δακτυλίου μελετήθηκε η έκφραση του GPER και επιλεγμένων γονιδίων της ομοιοστασίας του μεσοσπονδύλιου δίσκου, σε επίπεδο mRNA. Από την ανάλυση RT-qPCR, προέκυψε πως δεν υπάρχει μεταβολή της έκφρασης του GPER μεταξύ νεαρών και γηρασμένων κυττάρων ινώδους δακτυλίου, ενώ τα γονίδια που κωδικοποιούν τις μεταλλοπρωτέασες MMP-3, -9 και την ιντερλευκίνη 6 παρουσίασαν αυξορύθμιση στα γηρασμένα κύτταρα ινώδους δακτυλίου. Επίσης, σε πρωτεϊνικό επίπεδο, η έκφραση του GPER δεν παρουσίασε μεταβολή μεταξύ βόειων νεαρών και γηρασμένων κυττάρων, με το αποτέλεσμα να επιβεβαιώνεται και στα αντίστοιχα ανθρώπινα κύτταρα.
Ο ίδιος κύκλος πειραμάτων πραγματοποιήθηκε για τα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα. Τα κύτταρα χαρακτηρίστηκαν ως γηρασμένα με βάση τα χαρακτηριστικά που προαναφέρθηκαν και μελετήθηκε το πρότυπο έκφρασης του GPER και επιλεγμένων γονιδίων του SASP. Βρέθηκε, λοιπόν, πως υπάρχει μια τάση ελάττωσης των επιπέδων του GPER στα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα, αυξορύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις MMP-3 και -9 και την HO-1, ενώ μειώνονται τα επίπεδα του γονιδίου που κωδικοποιεί το κολλαγόνο τύπου ΙΙ. Επιπλέον, η μείωση των επιπέδων του GPER στα γηρασμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε και σε επίπεδο πρωτεΐνης, τόσο στα βόεια, όσο και στα ανθρώπινα κύτταρα.
Στη συνέχεια, προκειμένου να μελετηθεί η επίδραση της 17β-οιστραδιόλης σε κύτταρα μεσοσπονδύλιου δίσκου, πραγματοποιήθηκε η δοκιμασία MTT σε νεαρά κύτταρα ινώδους δακτυλίου και πηκτοειδούς πυρήνα, τα οποία επωάστηκαν με ένα αρκετά μεγάλο φάσμα συγκεντρώσεων 17β-οιστραδιόλης, και προέκυψε πως δεν είναι τοξική ούτε για τα βόεια, αλλά ούτε και για τα ανθρώπινα κύτταρα μεσοσπονδύλιου δίσκου.
Το επόμενο βήμα ήταν η διερεύνηση της πιθανής αντιοξειδωτικής δράσης της 17β-οιστραδιόλης για επιλεγμένες συγκεντρώσεις επώασης με αυτή, σε βόεια κύτταρα ινώδους δακτυλίου και πηκτοειδούς πυρήνα. Συγκεκριμένα, μελετήθηκε η επίδρασή της στα βασικά και στα διεγερμένα από H2O2 επίπεδα ROS και από τα αποτελέσματα της δοκιμασίας DCFH-DA φαίνεται πως υπήρχε μια τάση για μείωση των επαγόμενων από H2O2 επιπέδων ROS.
Ακολούθως, μελετήθηκε η επίδραση της 17β-οιστραδιόλης στην έκφραση του υποδοχέα GPER σε νεαρά κύτταρα ινώδους δακτυλίου, ύστερα από επώαση για 48 ώρες με τις εξής συγκεντρώσεις: 0, 1, 10, 100 nM και 1 μΜ. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, δεν βρέθηκε κάποια σημαντική μεταβολή στην έκφραση του GPER σε γονιδιακό επίπεδο, ωστόσο, φαίνεται πως η επώαση των κυττάρων ινώδους δακτυλίου με 1 μΜ 17β-οιστραδιόλης για 48 ώρες, οδήγησε στην αυξορύθμιση του γονιδίου που κωδικοποιεί το κολλαγόνο τύπου ΧΙΙ.
Τα παραπάνω πειράματα πραγματοποιήθηκαν και σε νεαρά κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα, για τη μελέτη της επίδρασης της 17β-οιστραδιόλης στα επίπεδα έκφρασης του GPER. Το πρότυπο έκφρασης του υποδοχέα δεν βρέθηκε να εμφανίζει σημαντική μεταβολή για καμία από τις συγκεντρώσεις 17β-οιστραδιόλης που χρησιμοποιήθηκαν.
Στη συνέχεια, η μελέτη της επίδρασης της 17β-οιστραδιόλης στην έκφραση του οιστρογονικού υποδοχέα GPER επεκτάθηκε σε γηρασμένα κύτταρα μεσοσπονδύλιου δίσκου, προκειμένου να διερευνηθεί ο ρόλος της 17β-οιστραδιόλης στην εκφύλιση του ιστού. Η επώαση των βόειων γηρασμένων κυττάρων ινώδους δακτυλίου με 1 μΜ 17β-οιστραδιόλης οδήγησε σε μείωση των μεταγραφικών επιπέδων του GPER ύστερα από 48 ώρες επώασης, καθώς και μειορύθμιση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις μεταλλοπρωτεάσες MMP-3 και -9.
Τα ίδια πειράματα πραγματοποιήθηκαν, επιπλέον, σε γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα και από αυτά δεν προέκυψε κάποια αλλαγή στα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του GPER. Ωστόσο, παρατηρήθηκε σημαντική αυξορύθμιση του γονιδίου που κωδικοποιεί την αγκρεκάνη, ύστερα από 48 ώρες επώασης με 1 μΜ 17β-οιστραδιόλης.αρχίσετε μια νέα διαδικασία κατάθεσης, προτείνονται τα ακόλουθα
Τέλος, εξετάστηκε η πιθανή αντιοξειδωτική δράση της 17β-οιστραδιόλης σε γηρασμένα κύτταρα ινώδους δακτυλίου και πηκτοειδούς πυρήνα, ύστερα από επώαση με συγκεντρώσεις 0, 1, 10, 100 nM και 1 μΜ για επτά ημέρες. Πράγματι, βρέθηκε μια δοσο-εξαρτώμενη τάση για μείωση των ενδοκυτταρικών επιπέδων ROS στα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα, αλλά καμία επίδραση στα γηρασμένα κύτταρα ινώδους δακτυλίου.
Συμπερασματικά, στην παρούσα εργασία δείχθηκε πως η 17β-οιστραδιόλη φαίνεται να δρα προστατευτικά έναντι της εκφύλισης του μεσοσπονδύλιου δίσκου περιορίζοντας τον καταβολικό φαινότυπο των γηρασμένων κυττάρων ινώδους δακτυλίου και πηκτοειδούς πυρήνα και ασκώντας αντιοξειδωτική δράση στα γηρασμένα κύτταρα πηκτοειδούς πυρήνα του μεσοσπονδύλιου δίσκου. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτή συγκλίνουν στην περαιτέρω ανάδειξη της σημασίας της 17β-οιστραδιόλης στη θεραπεία έναντι της εκφύλισης του μεσοσπονδύλιου δίσκου, λαμβάνοντας υπόψη και την παράμετρο της κυτταρικής γήρανσης, και επομένως μπορεί να συνεισφέρουν στο σχεδιασμό πιο στοχευμένων και αποδοτικών θεραπευτικών προσεγγίσεων για την αντιμετώπιση της οσφυαλγίας.
Λέξεις-κλειδιά:
Οσφυαλγία, Εμμηνόπαυση, Μεσοσπονδύλιος δίσκος, Ινώδης δακτύλιος (AF), Πηκτοειδής πυρήνας (NP), Εκφύλιση, GPER, 17β-οιστραδιόλη (Ε2), Οιστρογονικοί υποδοχείς, SASP, ECM
