Στοιχεία επταμελούς επιτροπής:
ΑΛΕΞΙΟΣ ΛΕΑΝΔΡΟΣ ΣΚΑΛΤΣΟΥΝΗΣ Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
ΜΗΤΑΚΟΥ ΣΟΦΙΑ Καθηγήτρια, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
ΑΛΗΓΙΑΝΝΗΣ ΝΕΚΤΑΡΙΟΣ Αναπληρωτής Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
ΜΑΓΟΥΛΑΣ ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ Καθηγητής Σχολής Χημικών Μηχανικών Ε.Μ.Π.
ΒΟΥΤΣΑΣ ΕΠΑΜΕΙΝΩΝΔΑΣ Αναπληρωτής Καθηγητής Σχολής Χημικών Μηχανικών Ε.Μ.Π.
ΓΚΙΚΑΣ ΕΥΑΓΓΕΛΟΣ Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Φαρμακευτικής, ΕΚΠΑ
ΑΣΗΜΟΠΟΥΛΟΥ ΑΝΔΡΕΑΝΑ Επίκουρη Καθηγήτρια, Τμήμα Χημικών Μηχανικών Α.Π.Θ.
Περίληψη:
Από τον προηγούμενο αιώνα μέχρι και σήμερα έχει σημειωθεί μία αλματώδης ανάπτυξη στον τομέα των θετικών επιστημών. Οι νέες και καινοτόμες τεχνολογίες που ήρθαν στο προσκήνιο, οδήγησαν στη σημαντική βελτίωση της ποιότητας της ανθρώπινης ζωής αλλά και στην αύξηση του προσδόκιμού της. Παρόλα αυτά, τα συγκεκριμένα επιτεύγματα δεν ήρθαν χωρίς κάποιο αντίτιμο. Η παραγωγή, η χρήση και η διάθεση των χημικών παραπροϊόντων της βιομηχανίας, είχε σε πολλές περιπτώσεις αρνητικές συνέπειες τόσο στην ανθρώπινη υγεία όσο και στο φυσικό περιβάλλον. Σε αυτό λοιπόν το πλαίσιο αναπτύχθηκε μια έντονη ερευνητική δραστηριότητα με σκοπό την αντικατάσταση των χρησιμοποιούμενων τοξικών διαλυτών με καινούργιους, φιλικούς προς το περιβάλλον. Το αποτέλεσμα αυτής της προσπάθειας οδήγησε στην εύρεση των ‘πράσινων’ και φιλικών προς το περιβάλλον τεχνικών εκχύλισης όπως τα υπερκρίσιμα ρευστά, η επιταχυνόμενη εκχύλισης, το υποκρίσιμο νερό και η εκχύλιση με μικροκύματα πολλές από τις οποίες έχουν ήδη βρει το δρόμο της βιομηχανικής εφαρμογής.
Αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η εφαρμογή, η μελέτη και η βελτιστοποίηση φιλικών προς το περιβάλλον διεργασιών εκχύλισης, για την παραγωγή δραστικών εκχυλισμάτων από φυτά με φαρμακολογική δράση, μέσα από τη χρήση σύγχρονων και καινοτόμων τεχνικών εκχύλισης όπως: η εκχύλιση με υπερκρίσιμο διοξείδιο του άνθρακα, η επιταχυνόμενη εκχύλιση και η εκχύλιση με υποκρίσιμο νερό. Για τη συγκεκριμένη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν φυτά της Ελλάδας, γνωστά για τη φαρμακευτική τους δράση όπως ο Sideritis raeseri ssp. attica, η ρητίνη του φυτού Cistus creticus ssp. creticus και τα υπέργεια τμήματά του, καθώς και οι ρίζες του φυτού Glycyrrhiza glabra. Στόχος, ήταν η εφαρμογή των παραπάνω τεχνικών εκχύλισης για την παραγωγή δραστικών εκχυλισμάτων με υψηλές αποδόσεις, αυξημένο φορτίο σε φαινόλες και φλαβονοειδή και υψηλή αντιοξειδωτική δράση.
Για την παραλαβή ολόκληρου του φάσματος των δευτερογενών μεταβολιτών μιας δρόγης απαιτείται η χρήση διαλυτών διαφορετικής πολικότητας. Συγκεκριμένα, μία συνήθης εφαρμογή διαλυτών κλιμακούμενης πολικότητας, η οποία είναι ικανή να παραλάβει ολόκληρο το φάσμα των βιοδραστικών συστατικών, περιλαμβάνει αρχικά τη χρήση διχλωρομεθανίου για την παραλαβή των άπολων συστατικών του φυτού, στη συνέχεια χρήση μεθανόλης, για τα μέσης πολικότητας συστατικά και τέλος χρήση νερού.
Τα πρώτο φυτό που μελετήθηκε στην παρούσα διατριβή ήταν το είδος S. raeseri ssp. attica στο οποίο έγινε η μελέτη ενός πρωτοκόλλου εκχύλισης, με σκοπό την αντικατάσταση των προαναφερθέντων, οργανικών διαλυτών (διχλωμομεθανίου και μεθανόλης), με διαλύτες φιλικούς προς το περιβάλλον (υπερκρίσιμο CO2 και αιθανόλη) για την παραλαβή εκχυλισμάτων με υψηλές αποδόσεις και υψηλή βιολογική δράση. Συγκεκριμένα, θεσπίσθηκε ένα πρωτόκολλο εκχύλισης το οποίο περιλάμβανε αρχικά, την χρήση υπερκρίσιμου διοξειδίου του άνθρακα (με προσθήκη συνδιαλύτη) σε διάφορες συνθήκες (για την εκχύλιση των μη πολικών συστατικών του φυτού) και στην συνέχεια εισαγωγή του υπολείμματος στην συσκευή επιταχυνόμενης εκχύλισης (ASE) και εκχύλιση με αιθανόλη και νερό για την παραλαβή των πιο πολικών συστατικών. Τα εκχυλίσματα τα οποία προέκυψαν από τη διεργασία δεν ήταν μόνο απαλλαγμένα από οργανικούς διαλύτες, αλλά αποδείχτηκαν δραστικότερα, συγκρινόμενα με αυτά της συμβατικής μεθόδου, διαθέτοντας υψηλότερο φορτίο σε φαινόλες και υψηλότερη αντιοξειδωτική δράση.
Τέλος, το εκχύλισμα που παρουσίασε την καλύτερη αντιοξειδωτική δράση και το υψηλότερο φορτίο σε φαινολικά συστατικά, υποβλήθηκε σε φυτοχημική μελέτη για την απομόνωση των κύριων μεταβολιτών του. Ταυτοποιήθηκαν έξι μεταβολίτες: ο λαβαντουλιφολιοσίδης, ο ακτεοσίδης, ο 7-O-6΄΄΄-O-ακετυλο-β - D - αλλοπυρανοσυλο - (1→2) -β - D -γλυκοπυρανοσίδης της υπολετίνης, ο λεονοσίδης Α, ο 7-O-6΄΄΄-O-ακετυλο- β-D- αλλοπυρανοσυλο -(1→2)-β-D- γλυκοπυρανοσίδης της ισοσκουτελαρεΐνης, και ο 7-O-6΄΄΄-O-ακετυλο- β-D- αλλοπυρανοσυλο -(1→2)-β-D- γλυκοπυρανοσίδης της 4΄-Ο-μεθυλοϋπολετίνης, εκ τον οποίων ο λεονοσίδης Α απομονώνεται για πρώτη φορά από το γένος Sideritis.
Όσον αφορά το είδος Cistus creticus, έγινε μελέτη της διεργασίας της υπερκρίσιμης εκχύλισης για την παραλαβή των μη πολικών συστατικών της ρητίνης του φυτού (λάδανο) και των υπέργειων τμημάτων του, καθώς και η σύγκριση αυτών με κλασσικές τεχνικές εκχύλισης, όπως η υδροαπόσταξη και η εκχύλιση με υπερήχους. Από τη μελέτη των εκχυλισμάτων και των αιθέριων ελαίων που παρασκευάσθηκαν, παρατηρήθηκαν σημαντικές ποιοτικές και ποσοτικές διαφορές, οι οποίες σχετίζονται με την διαδικασία εκχύλισης. Σημαντικότερη εξ αυτών αποτέλεσε η διαφορά στη συγκέντρωση του μεταβολίτη οξειδίου της μανοόλης, όπου για το αιθέριο έλαιο της υδραπόσταξης υπολογίσθηκε στα 14.4% ενώ για την υπερκρίσιμη εκχύλιση στο 2.57% Φαίνεται ότι οι υψηλές θερμοκρασίες και οι εκτεταμένοι χρόνοι εκχύλισης εντός της συσκευής Clevenger οδηγούν στη θερμική αλλοίωση/μετατροπή ορισμένων συστατικών τα οποία με τη σειρά τους οδήγησαν στην υψηλή συγκέντρωση του μεταβολίτη, αποδεικνύοντας με αυτόν τον τρόπο ότι οι ηπιότερες συνθήκες της υπερκρίσιμης εκχύλισης αποτρέπουν τον θερμικό καταβολισμό, οδηγώντας στην παραλαβή ποιοτικά ανώτερων εκχυλισμάτων με αναλλοίωτα συστατικά.
Επιπλέον, το αιθέριο έλαιο το οποίο παρασκευάσθηκε από τη διεργασία της υπερκρίσιμης εκχύλισης διαθέτει πιο φυσικό άρωμα το οποίο θυμίζει περισσότερο του φρέσκου φυτού, διότι μέσα από την εφαρμογή μιας headspace ανάλυσης, αποδείχθηκε ότι το αιθέριο έλαιο αυτής περιέχει συστατικά, τα ποσοστά των οποίων παρουσιάζουν περισσότερα κοινά στοιχεία με αυτά της πηγής προέλευσης. Επιπλέον, το αιθέριο έλαιο της διεργασίας είναι και ποιοτικά ανώτερο διότι, λόγω των πολύ καλών εκχυλιστικών ιδιοτήτων της μεθόδου, συνεκχυλίζονται και άλλα, πιο βαριά δραστικά συστατικά τα οποία διαθέτουν σημαντικές αντιμικροβιακές ιδιότητες (εντ-3β-υδροξυ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης και ο οξικός εστέρας της ριμπενόλης), προσδίδοντας στο λαμβανόμενο αιθέριο έλαιο βιολογική μεγαλύτερη αξία.
Τέλος, σε επιλεγμένα εκχυλίσματα της υπερκρίσιμης εκχύλισης, τα οποία ήταν πλούσια σε βιοδραστικούς δευτερογενείς μεταβολίτες, πραγματοποιήθηκε φυτοχημική μελέτη για την απομόνωση των κυριότερων μεταβολιτών τους από όπου ταυτοποιήθηκαν: το 4,5-δι-έπι αριστολοχένιο, το εντ-οξείδιο της μανοόλης, το εντ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης, το εντ-3β-ακετοξυ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης (οξικός εστέρα της ριμπενόλης), το εντ-3β-υδροξυ-13-επι-οξείδιο της μανοόλης (ριμπενόλη), ο 4’-μεθυλαιθέρας της απιγενίνης (ακακετίνη), ο 3,3΄-διμεθυλαιθέρας της κερκετίνης, ο 3,4’-διμεθυλαιθέρας της κερκετίνης, ο 3-μεθυλαιθέρας της καιμπφερόλης, η απιγενίνη και ο 3-μεθυλαιθέρας της κερκετίνης.
Το τελευταίο φυτό το οποίο μελετήθηκε στην παρούσα εργασία ήταν οι ρίζες του φυτού G. glabra. Σκοπός της μελέτης αποτέλεσε η εφαρμογή και η βελτιστοποίηση της διεργασίας της υπερκρίσιμης εκχύλισης για την παραγωγή εκχυλισμάτων με σημαντικές αντιοξειδωτικές δράσεις, φορτίο σε φαινόλες και φλαβονοειδή, υψηλή συγκέντρωση γκλαμπριντίνης και ισχυρή ανασταλτική δράση έναντι του ενζύμου της τυροσινάσης. Για την επίτευξη του στόχου αυτού έγινε η εφαρμογή της Μεθοδολογίας Επιφάνειας Απόκρισης (Response Surface Methodology), όπου αρχικά έγινε η χρήση ενός Factorial σχεδιασμού 2 επιπέδων (2-level Factorial design), για την εύρεση των σημαντικών παραμέτρων της διεργασίας και στη συνέχεια ενός Central Composite σχεδιασμού για την εύρεση των βέλτιστων συνθηκών της εκχύλισης. Στη συνέχεια, εφαρμόζοντας έναν αλγόριθμο αριθμητικής βελτιστοποίησης, προσδιορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες παραλαβής εκχυλισμάτων από όπου και παρασκευάσθηκαν δύο εκχυλίσματα: ενός με υψηλή αντιοξειδωτική δράση στο ABTS (όμοια με αυτή του Trolox: IC50≈8 μg/mL), καθώς και ενός με ισχυρή λευκαντική δράση, η οποία είναι 4.5 φορές πιο ισχυρή από αυτή του πρότυπου αναστολέα (Kojic acid: IC50≈1.34 μg/mL).
Η παραπάνω μελέτη δε θα μπορούσε να θεωρηθεί ολοκληρωμένη αν δεν γινόταν και μια θεωρητική μελέτη αυτής μέσα από την εφαρμογή ενός μοντέλου πρόρρησης. Η περιγραφή έγινε με τη χρήση ενός μοντέλου εμβολικής ροής που προτάθηκε από τους των Sovová et al. (1994), το οποίο κατάφερε να περιγράψει πολύ καλά τα πειραματικά δεδομένα, ενώ ταυτόχρονα βοήθησε και στον υπολογισμό των συντελεστών μεταφοράς μάζας.
Τέλος, έλαβε χώρα και η μελέτη του υπολείμματος της υπερκρίσιμης εκχύλισης. Ένα υλικό το οποίο, αν και απαλλαγμένο από τα μη πολικά συστατικά, εξακολουθεί να είναι πλούσιο σε πολικούς μεταβολίτες, οι οποίοι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρασκευή εκχυλισμάτων με αξιόλογες βιολογικές δράσεις. Γι’ αυτό το λόγο, έγινε μία προσπάθεια αξιοποίησής του για την παρασκευή εκχυλισμάτων τα οποία θα χαρακτηρίζονται από καλή αντιοξειδωτική δράση και υψηλό φορτίο σε φαινόλες και φλαβονοειδή στη συσκευή της επιταχυνόμενης εκχύλισης. Και σε αυτή την περίπτωση επιλέχθηκε να γίνει μια μελέτη βελτιστοποίησης της εκχυλιστικής διεργασίας. Λόγω των πολύ καλών αποτελεσμάτων της Μεθοδολογίας Επιφάνειας Απόκρισης, έγινε η εφαρμογή ενός Central Composite σχεδιασμού, για τη βελτιστοποίηση της διεργασίας, κάνοντας χρήση διαλυτών, φιλικών προς το περιβάλλον όπως αιθανόλης/νερού και υποκρίσιμου νερού, από όπου και προέκυψαν εκχυλίσματα με αξιόλογες βιολογικές δράσεις και ιδιαίτερα υψηλές αποδόσεις οι οποίες αγγίζουν το 32% του ξηρού βάρους της δρόγης.
