Στοιχεία επιβλεπόντων καθηγητών:
Δημήτριος Χατζηνικολάου, Αναπληρωτής Καθηγητής Μικροβιακής Βιοτεχνολογίας, Τομέας Βοτανικής, Τμήμα Βιολογίας, Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών.
Περίληψη:
Πολλά αερόβια βακτήρια του εδάφους περιέχουν το φωσφο-ενολο-πυροσταφυλο-εξαρτώμενου σύστημα φωσφο-τρανσφεράσης (PTS), το οποίο τους επιτρέπει να χρησιμοποιούν ολιγομερή γλυκοζιδίων που προκύπτουν από κυτταρίνη ή/ και από αποικοδόμηση άλλων γλυκανών. Δύο βασικά συστατικά αυτού του συστήματος είναι (α) μια διαμεμβρανική φωσφοτρανσφεράση, η οποία φωσφορυλιώνει τις ολιγογλυκάνες, ενώ τις μεταφέρει εντός του κυττάρου και (β) μια ενδοκυτταρική ευρείας εξειδίκευσης GH1 β-Ρ-γλυκοζιδάση, η οποία υδρολύει περαιτέρω τις φωσφο-ολιγογλυκάνες που προέκυψαν. Αυτό το ένζυμο λειτουργεί μέσω ενός μηχανισμού στον οποίο εμπλέκονται δύο κατάλοιπα γλουταμικού οξέος, το μεν ως δότης πρωτονίων και το δε ως νουκλεόφιλη ομάδα. Στην παρούσα μελέτη, περιγράφονται τα αποτελέσματα των δομικών μελετών που διεξήχθησαν για μία 6-φωσφο-β-γλυκοζιδάση της οικογενείας 1-φωσφορικών γλυκοζιδασών (GH1) (EC 3.2.1.86, 6-P-β-GH1), η οποία είναι ικανή να υδρολύει τον β-1,4-γλυκοζιδικό δεσμό σε ένα μεγάλο αριθμό β-Ρ-δι-εξοζών και προέρχεται από θερμόφιλο μικροοργανισμό, σε αντίθεση με τις γνωστές δομές που έχουν προσδιορισθεί και μελετηθεί. Σκοπός ήταν ο προσδιορισμός του ενζύμου αγρίου τύπου στην ελεύθερη μορφή του και ως συμπλόκου με ανάλογα υποστρώματος. Το ένζυμο που μελετάται έχει απομονωθεί από το γονιδίωμα του θερμόφιλου βακτηρίου Geobacillus sp. SP24, από το ηφαιστειακό περιβάλλον της Σαντορίνης, Αιγαίο Πέλαγος. Πιο συγκεκριμένα, πραγματοποιήθηκαν δοκιμές κρυστάλλωσης με την τεχνική διάχυσης ατμών, χρησιμοποιώντας τις εγκαταστάσεις πρωτεϊνικής κρυσταλλογραφίας (μονάδα ρομποτικής κρυστάλλωσης) στο Ινστιτούτο Βιολογίας, Φαρμακευτικής Χημείας και Βιοτεχνολογίας του Εθνικού Ιδρύματος Ερευνών (ΕΙΕ). Η επιλογή των συνθηκών κρυστάλλωσης σχεδιάστηκε ορθολογικά με βάση αφενός τα αποτελέσματα βιβλιογραφικής έρευνας και αφετέρου τις διαθέσιμες στο εμπόριο συνθήκες κρυστάλλωσης (crystallization screens). Η επιλογή των καταλληλότερων εμπορικών συνθηκών διεξήχθη μετά από λεπτομερή διερεύνηση των ιδιοτήτων του ενζύμου με βάση ομόλογα ένζυμα της οικογενείας GH1. Θετικά αποτελέσματα (hits) παρατηρήθηκαν αρχικά σε πολλές διαφορετικές συνθήκες, είτε ως λεπτές πλάκες (διδιάστατοι κρύσταλλοι) είτε ως βελονοειδής κρύσταλλοι. Ακολούθησε βελτιστοποίηση της αναλογίας πρωτεΐνης: κατακρημνιστικού παράγοντα και με εφαρμογή της μεθόδου της μικροσποράς (seeding) αναπτύχθηκαν μονοκρύσταλλοι της 6-P-β-GH1 σε ραβδοειδή μορφή παρουσία PEG 3350, ιωδιούχου νατρίου και Bis-Tris propane pΗ 7. Παράλληλα με την εκπόνηση της παρούσας εργασίας, προσδιορίσθηκε η τρισδιάστατη δομή ενός ενζύμου από ένα θερμόφιλο Gram θετικό βακτήριο του εδάφους και για λόγους σύγκρισης πραγματοποιήθηκαν μελέτες μοντελοποίησης της 6-P-β-GH1. Χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικοί εξυπηρετητές i-Tasser και Phyre2 για τη δημιουργία των προβλεπόμενων μοντέλων-δομών. Στη συνέχεια ακολούθησε σύγκριση των μοντέλων με την τρισδιάστατη δομή που προσδιορίστηκε από το θερμόφιλο βακτήριο του εδάφους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το μεν μοντέλο που προτάθηκε από το Phyre 2 μοιάζει με την αλυσίδα που έχει δράση γλυκοζιδάσης από την προσδιορισμένη δομή, ενώ αυτό του i-Tasser με την αλυσίδα που έχει δράση γαλακτοσιδάσης. Προκαταρκτικός χαρακτηρισμός των κρυστάλλων της 6-P-β-GH1 για τον έλεγχο της περιθλαστικής τους ικανότητας έγινε με χρήση της συμβατικής πηγής ακτίνων-Χ που είναι εγκατεστημένη στο ΕΙΕ, ωστόσο το μέγεθος των κρυστάλλων είναι τέτοιο που δεν επιτρέπει τη συλλογή ικανονοποιητικών δεδομένων. Για το σκοπό αυτό, προβλέπεται η συλλογή δεδομένων υψηλής ανάλυσης, πηγές συγχροτρονικής ακτινοβολίας σε μεγάλες Ευρωπαϊκές εγκαταστάσεις.
Λέξεις-κλειδιά:
ένζυμο, 6-φωσφο-β-γλυκοζιδάση, γλυκοζιδικές υδρολάσες, πρωτεϊνική κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ, δομικές μελέτες
